活禽市場(chǎng)是人感染禽流感病毒的重要來(lái)源之一。近日，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病所聯(lián)合江西省疾控中心在Arch Virol雜志上發(fā)表題為《Identification of a novelreassortant A (H9N6) virus in live poultry markets in Poyang Lake region, China》的論文，研究首次在江西省南昌市鄱陽(yáng)湖區(qū)分離鑒定了一株新型重配H9N6流感病毒（JX-H9N6）。與以往報(bào)告的H9N6不同，JX-H9N6起源于2014年H9N2和H6N6兩種病毒的重組，雖然該H9N6病毒顯示為低致病性特征，但是其HA、PB1、PA、M和NS蛋白存在多個(gè)可增加哺乳動(dòng)物的傳播力和毒力的突變。目前，H9N2和H6N6 禽流感 均廣泛分布在家禽中并有助于產(chǎn)生新的重組病毒并造成人類感染，本研究再次強(qiáng)調(diào)了加強(qiáng)禽類監(jiān)測(cè)對(duì)早期預(yù)測(cè)人類感染的重要性。

研究背景

流感病毒屬于正黏病毒科流感病毒屬，為單負(fù)鏈分節(jié)段具有包膜結(jié)構(gòu)的RNA病毒。流感病毒具有廣泛的宿主范圍，可同時(shí)感染哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類等。根據(jù)其表面蛋白血凝素蛋白HA和神經(jīng)氨酸酶NA的抗原性差異，可分為至少18個(gè)H亞型（H1-H18）和11個(gè)N亞型（N1-N11）。到目前為止，除了H17N10和 H18N11病毒只在蝙蝠中檢測(cè)到外，所有其它HA和NA亞型均在禽類中有報(bào)道。流感病毒的分段RNA基因組與RDPR聚合特點(diǎn)使其非常容易通過(guò)突變或重組逃逸宿主免疫系統(tǒng)。

禽類尤其是水禽，是禽流感病毒的天然宿主。禽流感病毒可以偶爾"跳躍"，越過(guò)寄主屏障感染哺乳動(dòng)物人類。人類通常沒(méi)有預(yù)先存在的免疫力禽流感。禽流感傳染給人一般導(dǎo)致溫和或無(wú)癥狀感染，只有少數(shù)亞型領(lǐng)先嚴(yán)重肺炎甚至死亡。在歷史上已知的可感染人類的禽流感病毒有H5N1, H5N6, H6N1, H7N2, H7N3, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7和H10N8。

H9N2禽流感目前普遍存在家禽和野鳥(niǎo)中，該病毒于1966年首次報(bào)道，1994年在中國(guó)廣東省的一個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)中檢測(cè)到，此后，H9N2禽流感病毒偶爾通過(guò)物種屏障感染哺乳動(dòng)物和人類。1999年，中國(guó)學(xué)者成功從有流感樣癥狀的患者中分離出一種 H9N2病毒，2003年，中國(guó)又報(bào)道了17例人感染H9N2禽流感病例，此外，研究顯示，2013年人感染的H7N9和H10N8中的六個(gè)內(nèi)部基因也源自H92禽流感，云南及廣東省的H5N6病毒的監(jiān)測(cè)也證明了其內(nèi)部基因病毒已逐漸被H9N2病毒內(nèi)部基因替換，從而促進(jìn)了H9N2在家禽中的傳播。

自2009年以來(lái)，國(guó)家流感中心就在全國(guó)31個(gè)省市自治區(qū)的活家禽市場(chǎng)和野生鳥(niǎo)類棲息地進(jìn)行了采集樣品和禽流感病毒監(jiān)測(cè)。位于中國(guó)省江西的鄱陽(yáng)湖是亞洲的候鳥(niǎo)一個(gè)主要的聚集地，這一地區(qū)的居民鳥(niǎo)類和候鳥(niǎo)增加了禽流感病毒的傳播和重組。本研究則首次在鄱陽(yáng)湖地區(qū)鑒定發(fā)現(xiàn)了一種新型重組H9N6流感病毒。

Potential origin of the JX-H9N6 virus.

結(jié)果速覽

1、一種新型重配H9N6流感病毒的分離與鑒定
研究者從2014年3月-12月之間于鄱陽(yáng)湖地區(qū)11個(gè)活禽市場(chǎng)中收集的683份樣本中分離得到429株病毒，包括159株H9N2，47株H5N6，33株H6N6，20株H7N9，4株H3N2，4株H5N8，3株H4N2，3株H4N6，2株H11N3，1株H7N2，1株H9N6以及90個(gè)混合感染樣本。

H9N6是從2014年4月22日江西省南昌市新建縣活禽市場(chǎng)的糞便樣本分離得到，病毒被命名為A/Environment/Jiangxi/24429/-2014(H9N6)，以下簡(jiǎn)稱 JXH9N6。JX-H9N6 全基因組序列已提交到GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)應(yīng)的序列號(hào)為EPI861128至EPI861135。JX-H9N6在MDCK和A549細(xì)胞中的TCID50分別為10 5.75/mL和10 6.3/mL，EID50為10 10.5/mL。

2、新型重配H9N6流感病毒序列特點(diǎn)與系統(tǒng)進(jìn)化分析

全基因組序列分析結(jié)果顯示（表 1），JX-H9N6的PB2、PA、HA和MP與2013–2014浙江省H9N2分離株相似度高達(dá)99%，NS與A/Zhejiang/DTID-ZJU01/2013(H7N9)，PB1與A/chicken/Jiangxi/13537/2014(H7N9)同源性最高，NA和NP與江西省 2014年分離的H10N6病毒株的同源性最高。

與此相比，JX-H9N6與其他H9N6病毒的HA相似性僅有75.6–95.3%，NA的相似性僅有81.5–86.5%（表2）。


對(duì)8個(gè)片段進(jìn)行貝葉斯共進(jìn)化分析結(jié)果表明，JX-H9N6病毒與早期報(bào)道的H9N6病毒不同，表明JX-H9N6最早來(lái)自A/chicken/Jiangxi/-19426/2014-like H9N2和H6N6流感病毒的重配，重配時(shí)間發(fā)生與2014年的1月和3月。

3、宿主特異性的特征標(biāo)記、受體結(jié)合特點(diǎn)與致病性分析

表3綜述了JX-H9N6病毒的宿主特異性、受體結(jié)合特點(diǎn)與致病性特點(diǎn)。

JX-H9N6的HA裂解部位僅包含一個(gè)單一的堿性(PSRSSR↓GLF)，表明該病毒是一個(gè)低致病性禽流感。JX-H9N6的HA中Q226L替換表明病毒的增加α2,6 與唾液酸受體的結(jié)合與促進(jìn)哺乳動(dòng)物之間的傳輸能力。

JX-H9N6的HA蛋白含有七個(gè)N-糖基化位點(diǎn)：分別位于21, 73, 128，289、296、304和483。但是JX-H9N6卻缺乏所有6株早期報(bào)告的H9N6共有的210位可能的糖基化位點(diǎn)，與2012年以來(lái)從鳥(niǎo)類和人中分離出來(lái)的H9N2最相似（補(bǔ)充圖2），210位置的N-糖基化部位的損失的功能需要進(jìn)一步研究。

此外，JX-H9N6在NA蛋白質(zhì)莖部位置（59–69）含有11個(gè)氨基酸刪除，表明病毒已成為很好地適應(yīng)陸禽。然而，PB2蛋白627和701分別保持E和D。PB1蛋白的L13P和L473V替代以及PA蛋白的K356R置換均有可能增加病毒的聚合酶活性、復(fù)制效率和在哺乳動(dòng)物中的毒力。M1蛋白N30D和T215A替換以及NS1蛋白A/P42S和T/D/V/R/A127N的替代有可能會(huì)增加其在哺乳動(dòng)物中毒力，此外，M2蛋白中還存在金剛烷胺的抗性替代S31N。

4、靜脈致死性指數(shù)試驗(yàn)
接受靜脈注射JX-H9N6病毒或?qū)φ詹《咀⑸涞碾u在在10天觀察期間均為顯示流感感染的癥狀，表明JX-H9N6 病毒是低致病性禽流感。

小 結(jié)

1、關(guān)于H9N6禽流感的報(bào)道很少，首個(gè)H9N6病毒于1977年在中國(guó)香港特別行政區(qū)被發(fā)現(xiàn)。此后分別于1988年在美國(guó)、2006年在越南、2010年、2013和2014在斯洛伐克的禽流感監(jiān)測(cè)中有報(bào)道。目前，這是首次中國(guó)大陸發(fā)現(xiàn)H9N6病毒的報(bào)道，也是首次將從雞分中分離出來(lái)H9N6的報(bào)道。

2、系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，JX-H9N6和以前報(bào)道的H9N6病毒沒(méi)有密切聯(lián)系，是一種H9N2和H6N6重組病毒株。分子年代分析表明，JX-H9N6起源于H9N2和H6N6病毒的重組，可能發(fā)生2014年1月-3月之間。如其他研究報(bào)告所述，同期H6N6也提供其N6基因給其他流感病毒亞型，導(dǎo)致H3N6、H5N6和H10N6病毒的出現(xiàn)。

3、H9N2在世界范圍內(nèi)的家禽和野禽中廣泛分布，該病毒被認(rèn)為是最有可能在人類中引發(fā)下一次流感大流行的候選者，主要原因：一方面由于其在1998年以來(lái)引起了人類的感染并從2013年以來(lái)在禽類中的不斷增加，另一方面，H9N2病毒內(nèi)部基因在各種禽流感病毒具有貢獻(xiàn)，包括中國(guó)自2013年發(fā)現(xiàn)的人感染H7N9、H10N8、H5N6等，而H9N2和H6N6病毒在中國(guó)家禽中又廣泛存在。為此，本研究強(qiáng)調(diào)了H9N2和H6N6可能會(huì)成為新型重配病毒庫(kù)。

4、雖然JX-H9N6 為低致病性禽流感，但是一些突變位點(diǎn)的存在，包括HA蛋白的Q226L以及其它內(nèi)部基因的突變，都提示病毒獲得了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的復(fù)制能力。此外，NA莖部區(qū)域11個(gè)氨基酸的刪除可能有助于幫助這些H9N6病毒適應(yīng)陸禽。

中國(guó)活禽市場(chǎng)缺乏生物安全措施導(dǎo)致了活禽市場(chǎng)各種禽流感病毒傳播和累計(jì)，根據(jù)“基因調(diào)頻”理論，家禽種類混合的養(yǎng)殖會(huì)促進(jìn)流感病毒的種間傳播和重組。近年來(lái)，中國(guó)報(bào)告幾種新型重組病毒引起的人類感染如H5N6、H7N9和H10N8病毒。因此，持續(xù)監(jiān)視、嚴(yán)格的動(dòng)物檢疫和先進(jìn)的生物安全措施，包括隔離期間家禽養(yǎng)殖和銷售在中國(guó)是至關(guān)重要的。