摘要：研制了豬腦心肌炎（ EMCV ）與豬圓環(huán)病毒（PCR-2 ）二聯(lián)滅活疫苗 EMCV/PCR-2 ，并選擇小鼠和豬進(jìn)行疫苗的安全性與免疫效力試驗(yàn)。結(jié)果顯示： EMCV/PCR-2二聯(lián)滅活疫苗對(duì)小鼠、仔豬、后備母豬和不同妊娠階段母豬均安全。免疫小鼠時(shí)的最佳接種劑量為0.1ｍＬ ，首免和二免的保護(hù)率分別高達(dá)80％和100％ ，免疫效果均高于相應(yīng)單苗，并可產(chǎn)生各自的高水平抗體；免疫仔豬時(shí)的最佳接種劑量為２ｍＬ ，免疫效果略高于相應(yīng)單苗和 PCV-2商品苗，且平均日增重最高，料肉比最低，攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明可完全有效抵抗 EMCV 和 PCR-2強(qiáng)毒株的攻擊。該疫苗為２種疾病的聯(lián)合免疫提供了可能，達(dá)到“一針防兩病”的效果，滿足了 EMCV免疫的潛在需求。

腦心肌炎（ encephalomyocarditis，EMC）是由腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis vrus ， EMCV）引起的一種以腦炎、心肌炎和繁殖障礙為主要臨診特征的人獸共患傳染病。自然條件下，EMCV 可感染家畜、嚙齒類動(dòng)物、野生動(dòng)物以及靈長(zhǎng)類動(dòng)物，其中嚙齒類動(dòng)物是 其 自然 貯存 宿 主 和 主 要 傳 播者，小鼠易感性極高，是最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，而感染最為廣泛和危害最為嚴(yán)重的家畜是豬，可致使妊娠母豬發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和弱仔，仔豬發(fā)生致死性心肌炎和腦炎等。近年來(lái)，通過病毒分離鑒定和血清學(xué)檢測(cè)證實(shí)人感染發(fā)病也時(shí)有發(fā)生。豬圓環(huán)病毒病（porcine circovirus disease， PCVＤ）是由豬圓環(huán)病毒 ２ 型（porcine circovirus 2， PCR-2）引起的以仔豬斷奶后全身衰竭綜合征（ PMWS ）和豬皮炎腎病綜合征（ PDNS ）為代表的多種疾病的總稱，其臨診表現(xiàn)多樣，主要特征為體質(zhì)下降、消瘦、貧血、黃疸、生長(zhǎng)發(fā)育不良、腹瀉、呼吸困難、母豬繁殖障礙、內(nèi)臟器官及皮膚廣泛病理變化。此外，還可導(dǎo)致豬群產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫抑制，從而導(dǎo)致繼發(fā)或發(fā)生其他傳染病。

EMCV 和 PCR-2 是當(dāng)前國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)中感染率很高的２種重要的病原體，筆者前期研究已證明在養(yǎng)豬生產(chǎn)中二者混合或相互繼發(fā)感染現(xiàn)象普遍存在，使得臨床表現(xiàn)更為復(fù)雜，危害更為嚴(yán)重。使用安全高效的疫苗免疫易感豬則是防控 ２ 種疾病的最有效途徑。 2010年以來(lái)，國(guó)內(nèi)外已有多家商品化的PCR-2疫苗注冊(cè)上市，疫苗類型主要為全病毒滅活苗和亞單位苗，臨床大面積應(yīng)用的結(jié)果證實(shí)這些疫苗均具有良好的免疫保護(hù)效果。國(guó)外早已成功研制出ＥＭＣ滅活苗和弱毒活疫苗，近年來(lái)新型基因工 程 苗 的 研 發(fā) 也 獲 得 較 大 進(jìn) 展。而 EMCV/PCR-2二聯(lián)滅活疫苗的研究尚未見報(bào)道，為了降低疫苗成本和免疫應(yīng)激，簡(jiǎn)化免疫程序，本試驗(yàn)從生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，首次探索研制 EMCV/PCR-2二聯(lián)滅活疫苗，并進(jìn)行免疫效力試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)其免疫保護(hù)性能。

１、材料與方法

１.１ 病毒、細(xì)胞和試驗(yàn)動(dòng)物

豬源 EMCV JZ1201株和 YM13 株均由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存，測(cè)定其 TCID 50 為 10 －9.66/0.1ｍＬ和 10 －8.51 /0.1ｍＬ，分別用于制備疫苗和攻毒保護(hù)試驗(yàn)。PCR-2河南流行株 HNYY由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存，生物學(xué)特性和免疫原性由高金良等做過相關(guān)研究，證實(shí)可作為 PCR-2疫苗候選株，經(jīng) SYBR Geen I實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法測(cè)定病毒拷貝數(shù)為3.351×106Copies/μL ，用于制備疫苗。BHK-21傳代細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存， PK-15傳代細(xì)胞由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)姜平教授惠贈(zèng)。6周齡SPF級(jí)健康昆明小鼠由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)鄭振宇教授惠贈(zèng)，檢測(cè)EMCV和PCR-2的ELISA抗體均為陰性。 3～4周齡健康仔豬由河南省豐源種豬場(chǎng)提供，8月齡后備母豬和不同妊娠階段母豬由洛陽(yáng)市鵝宿種豬場(chǎng)提供，檢測(cè)EMCV 和PCR-2的ELISA 抗體均為陰性，在隔離條件下飼養(yǎng)。

１.２ 主要試劑

RPMI-1640 、新生牛血清等購(gòu)自美國(guó) Hyclone公司；甲醛購(gòu)自南通江天化學(xué)品有限公司；進(jìn)口白油由遼寧益康生物制品有限公司提供；透析袋和聚乙二醇 20000 （PEG20000）分別購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司和上海研域生物科技有限公司； PCR-2 商品苗（LG 株）購(gòu)自哈爾濱某公司。

１.３ EMCV 種毒培養(yǎng)條件的確定

將 JZ1201 株作連續(xù)10 倍稀釋成 TCID50 分別為 10 －3.0 /0.1ｍＬ 、 10－4.0/0.1ｍＬ 、 10－5.0/0.1ｍＬ ，接種 BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)至 16，20 ， 24 ， 30ｈ 時(shí)測(cè)定病毒滴度，以確定最佳接種劑量。根據(jù)上述確定的最佳接種劑量，將JZ1201 株接種 BHK-21 細(xì)胞，感作漂洗后分別加入ＤＭＥＭ 維持液 ４ ， ６ ， ８ｍＬ ，培養(yǎng)、收毒并測(cè)定病毒滴度，以確定最佳培養(yǎng)液用量。根據(jù)上述確定的最佳接種劑量和最佳培養(yǎng)液用量，將 JZ1201 株 BHK-21細(xì)胞，每隔４ｈ取上清測(cè)定病毒滴度，以繪制EMCV的增殖曲線，并確定最佳收毒時(shí)間。

１.４ 滅活疫苗制備

１.４.１ 種 毒 滅 活 和 滅 活 效 果 檢 驗(yàn)

向 制 備 的JZ1201 株 和HNYY 株 中 分 別 加 入 終 濃 度 為0.025％和0.3％的甲醛溶液，充分搖勻后，37 ℃滅活24ｈ和48ｈ ，期間每隔２～４ｈ振搖１次，以使病毒液被充分滅活。隨后吸取少量滅活后的２種疫苗毒，以1∶10稀釋后分別接種于 BHK-21 細(xì)胞和PK-15細(xì)胞，盲傳３代培養(yǎng)觀察，均應(yīng)無(wú)CPE出現(xiàn)，應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室建立的 EMCV VP1 基因 RT-PCR 方法和PCR-2ＯＲＦ － ２基因ＰＣＲ方法檢測(cè)結(jié)果均應(yīng)為陰性。同時(shí)均設(shè)同批未經(jīng)滅活的２種病毒液（1:10）作為對(duì)照。

１.４.２ 病毒液濃縮

應(yīng)用透析袋法進(jìn)行濃縮。在透析袋上面均勻?yàn)M PEG20000，將 JZ1201 株和HNYY株分別加入、結(jié)扎，透析4～6ｈ，收集濃縮后的病毒液，再用維持液平衡，使其變?yōu)樵w積的50％ 。

１.４.３ 疫苗制備及檢驗(yàn)

將滅活的JZ1201株和滅活并濃縮的HNYY 株，分別加入終濃度４％的吐溫－80 ，充分混勻，即為單苗水相；將滅活并濃縮的JZ1201株和HNYY株，按照體積比１:１的比例混勻，加入終濃度４％的吐溫－80，充分混勻，即為二聯(lián)苗水相。按照參考文獻(xiàn)的方法分別制成 EM-CV 滅活苗、 PCR-2滅活苗和 EMCV/PCR-2二聯(lián)滅活苗，檢測(cè)其物理性狀并進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。小鼠安全性試驗(yàn)中，選取６周齡 SPF 級(jí)健康昆明小鼠24只，隨機(jī)分為３組，每種疫苗１組，將所制備的３種疫苗分別各皮下分點(diǎn)注射0.3ｍＬ ，連續(xù)觀察14ｄ ，同時(shí)設(shè)立對(duì)照 4 只，同等條件下飼養(yǎng)，詳細(xì)記錄各組小鼠的臨床表現(xiàn)和注射部位變化。豬安全性試驗(yàn)中，將 ３ 種疫苗分別按一次單劑量接種安全性試驗(yàn)（２ｍＬ/頭）、單劑量重復(fù)接種安全性試驗(yàn)（首免 ２ｍＬ/頭， ２ 周后同等劑量二免）和一次超劑量接種安全性試驗(yàn)（４ｍＬ/頭），分別經(jīng)頸部肌肉注射 ３ 周齡健康仔豬各 ８ 頭、 ８ 月齡后備母豬各 ８ 頭和妊娠 30日齡、60 日齡、90 日齡母豬各 ８ 頭，同時(shí)每組各設(shè)空白對(duì)照 ４ 頭，同等條件下飼養(yǎng)。仔細(xì)觀察試驗(yàn)豬的精神、食欲、生長(zhǎng)速度、臨床變化等，并測(cè)量體溫（２次/日）至14ｄ 。各組妊娠豬在同等條件下飼養(yǎng)至分娩，觀察對(duì)繁殖性能及其所產(chǎn)仔豬的發(fā)育狀況。

１.５ 小鼠免疫效力檢驗(yàn)

１.５.１ 二聯(lián)苗免疫劑量試驗(yàn)

將二聯(lián)苗按 0.05 ，0.1 ，0.2ｍＬ 的劑量，分別免疫 ６ 周齡SPF級(jí)健康昆明小鼠各 10 只，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照，相同條件下隔離飼養(yǎng)，每周斷尾采血，分離血清以檢測(cè) EMCV中和抗體。免疫后第 ２ 周，對(duì)每組的 ５ 只小鼠用YM13株以100LD50 腹腔接種攻毒。其余小鼠以首免時(shí)的同等劑量二免，繼續(xù)每周斷尾采血，分離血清以檢測(cè) EMCV 中 和 抗體，在 二 免 后 第 ２ 周 再 用YM13株以100LD50腹腔接種攻毒，記錄小鼠存活數(shù)和死亡數(shù)。

１.５.２ 小鼠免疫試驗(yàn)

將40只６周齡SPF級(jí)健康昆 明 小 鼠 隨 機(jī) 分為 ５ 組，隔離飼養(yǎng)，分 別編為EMCV 滅 活 苗 組、 PCR-2 滅 活 苗 組、二 聯(lián) 苗 組、PCR-2商品疫苗組和正常對(duì)照組。各組每只小鼠均皮下分點(diǎn)注射１.５.１確定的疫苗劑量，14ｄ后同等劑量二免。分別于首免后１周采血，每周采１次至二免６周，分離血清用于檢測(cè)EMCV中和抗體和PCR-2 ELISA抗體，并繪制抗體水平消長(zhǎng)曲線。

１.６ 仔豬免疫效力檢驗(yàn)

１.６.１ 二聯(lián)苗免疫劑量試驗(yàn)

將二聯(lián)苗按1 ，2 ， 3ｍＬ 的劑量，分別經(jīng)頸部肌肉注射免疫 ３ 周齡健康仔豬各 ８ 頭， ２ 周后以同等劑量二免。同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，用生理鹽水代替疫苗注射 ３ｍＬ ，相同條件下隔離飼養(yǎng)。各組分別于免疫前、首免后第 ２ 周以及二免后第 2 、 4 周前腔靜脈采血，分離血清測(cè)定 EM-CV 中和抗體和 PCR-2 ELISA 抗體，并繪制抗體水平動(dòng)態(tài)曲線。各組于試驗(yàn)前稱量平均初始重，整個(gè)試驗(yàn)期間每日仔細(xì)觀察、記錄試驗(yàn)豬的健康情況、采食量、日增重及飼料報(bào)酬，１個(gè)月后計(jì)算平均末重、平均日采食量、平均日增重及料肉比，以測(cè)定不同免疫劑量對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響。

１.６.２ 攻毒保護(hù)試驗(yàn)

56 頭 ４ 周齡健康仔豬隨機(jī)分為 ７ 組，隔離飼養(yǎng)，分別編為 EMCV 滅活苗組、PCR-2 滅活苗組、二聯(lián)苗組、 PCR-2 商品疫苗組和 ３個(gè)對(duì)照組。根據(jù) １.６.１ 確定的最佳劑量， ４ 個(gè)試驗(yàn)組均肌肉注射相應(yīng)疫苗，14ｄ 后同等劑量二免。二免 ２周后每組隨機(jī)選?。搭^進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，具體操作見表１ ，其余４頭飼養(yǎng)至二免４周試驗(yàn)結(jié)束。攻毒后每日測(cè)量體溫，觀察臨床表現(xiàn)。

２、結(jié)果

２.１ EMCV種毒培養(yǎng)條件

２.１.１ 最佳接種劑量和培養(yǎng)液最佳用量

JZ1201株在 TCID50 為10－4.0/0.1ｍＬ的接種劑量時(shí)病毒滴度最高，為最佳接種劑量（表２ ）。用６ｍＬ培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)的病毒滴度最高， TCID50 高達(dá)10－9.65/0.1ｍＬ（表３）。

２.１.２ 增殖曲線測(cè)定和最佳收毒時(shí)間

JZ1201 株在接種 ４～８ｈ 時(shí)TCID50快速上升，12ｈ 后上升變得緩慢，20ｈ 時(shí)達(dá)到 10－9.51/0,.1ｍＬ ， 24ｈ 最高，為10－9.64/0.1ｍＬ ，隨后開始逐步下降，據(jù)此可確定最佳收毒時(shí)間為接毒后 20～24ｈ（表４）。其增殖曲線變化見圖１ 。

２.２ 病毒液滅活效果檢驗(yàn)

吸取少量滅活后的JZ1201株1：10稀釋后，接種于 BHK-21細(xì)胞盲傳３代無(wú) CPE 出現(xiàn)，應(yīng)用 RT-CPR 檢測(cè)結(jié)果為陰性，對(duì)照組則產(chǎn)生明顯 CPE ，RT-CPR 檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性（圖２、３ ）。吸取少量滅活后的HNYY株1：10稀釋后，接種于PK-15細(xì)胞盲傳３代，應(yīng)用PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性，對(duì)照組為陽(yáng)性（圖４ ）。

２.３ 疫苗檢驗(yàn)

３種疫苗外觀均為乳白色；冷水表面試驗(yàn)中，第１滴成云霧狀擴(kuò)散，以后各滴均不擴(kuò)散；3000 r/min 離心15min均不破乳和分層；黏度檢驗(yàn)結(jié)果均未超過5s 。無(wú)菌檢驗(yàn)中均無(wú)雜菌生長(zhǎng)。接種小鼠后，精神、食欲和體溫?zé)o異常，注射部位未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)，吸收良好。一次單劑量接種安全性試驗(yàn)、單劑量重復(fù)接種安全性試驗(yàn)和一次超劑量接種安全性試驗(yàn)結(jié)果證明，試驗(yàn)組仔豬和８月齡后備母豬發(fā)育良好，體溫、精神狀態(tài)和食欲均正常，接種部位無(wú)任何不良反應(yīng)，對(duì)照組也未見異常。試驗(yàn)組各階段妊娠母豬均未出現(xiàn)繁殖障礙，在正常預(yù)產(chǎn)期范圍內(nèi)產(chǎn)出發(fā)育正常的健康仔豬，同條件下飼養(yǎng)的對(duì)照組妊娠母豬也無(wú)異常臨床表現(xiàn)。

２.４ 小鼠免疫效力檢驗(yàn)

２.４.１ EMCV 中和抗體檢測(cè)

各組在首免二聯(lián)苗后，第１周內(nèi)均未檢測(cè)到中和抗體，第２周除0.05ｍＬ組外，其余２組已檢測(cè)到中和抗體。二免后第１周各試驗(yàn)組抗體水平快速升高，但0.2ｍＬ組顯著高于其他免疫組，第 ２ 周后差異更為顯著（表 ５、圖４ ）。

2.４.２ 攻毒保護(hù)率及最小免疫劑量試驗(yàn)

按照Reed-Muench 法計(jì)算 PD50 。二聯(lián)苗首免時(shí)的PD50（ A）為 10－0.45頭份，１個(gè)PD50 是0.35頭份；二免時(shí)的PD50 （ B）為 10－0.55頭份，１個(gè)PD50是0.28頭份，表示該疫苗在首免和二免時(shí)分別接種0.35頭份和0.28頭份即可使 50％ 小鼠獲得保護(hù)（表 ６ ）。另外， 0.1ｍＬ 組首次免疫后保護(hù)率為 80％ ，二免后保護(hù)率為100％ ，說(shuō)明注射 0.1ｍＬ 疫苗，無(wú)論是首免還是二免，均可獲得高保護(hù)率，因此可確定為最佳接種劑量。

２.４.３ 小鼠免疫試驗(yàn)

二聯(lián)苗和 EMCV 滅活苗的EMCV 中和抗體消長(zhǎng)曲線基本一致，均在首免２周時(shí)可測(cè)到，二免 ２ 周后快速升至峰值，隨后逐步緩慢下降（圖5），整體上二聯(lián)苗的中和抗體水平要略高于EMCV 滅活苗（表7）。二聯(lián)苗和 PCR-2滅活苗的PCR-2 ELISA抗體逐步上升（圖6），二免１周時(shí)均已達(dá)到1:800 ，商品苗僅至 1:400；二聯(lián)苗在二免 ３周至最高值1:3200 ，顯著高于其他２組，持續(xù)至二免 5 周時(shí)維持在1:1600，至二免 ６ 周時(shí)下降至 1:800 ，但仍高于PCR-2滅活苗和商品苗的1:400和1:200（表7）。

２.５ 仔豬免疫效力檢驗(yàn)

２.５.１ 二聯(lián)苗免疫劑量確定

二聯(lián)苗不同劑量免疫后， EMCV 中和抗體增長(zhǎng)曲線基本相似，均在首免２周時(shí)可檢測(cè)到，二免２周后快速升高，至二免４周時(shí)維持高水平效價(jià)。 ２ｍＬ組和３ｍＬ組差異不大，但都顯著高于１ｍＬ組（表８ ）。 PCR-2抗體同樣在首免２周時(shí)均可在血清中檢測(cè)到，但效價(jià)較低，二免２周后抗體水平快速升高，二免４周后仍可維持在高水平效價(jià)，２ｍＬ 組和３ｍＬ 組均高達(dá)1:3200（表８ ）。對(duì)照組平均日增重為0.39kg ，料肉比為2.33 。2ｍＬ免疫組的平均日增重最高，為0.62kg，比1ｍＬ 免 疫 組、 3 ｍＬ 免 疫 組 和 對(duì) 照 組 分 別 增 加 了59.0％ 、 24.0％和40.9％ ，料肉比最低 （1.65），比１ｍＬ 免 疫 組、 ３ ｍＬ 免 疫 組 和 對(duì) 照 組 分 別 降 低 了2.94％ 、 21.05％和29.18％（表９）。

２.５.２ 攻毒保護(hù)試驗(yàn)

EMCV 滅活苗組在整個(gè)攻毒期內(nèi)試驗(yàn)豬未出現(xiàn)EMC的臨床特征，攻毒后第１周體溫均未超過39.5℃ ，第２周有２ｄ 、第３周有１ｄ體溫超過39.5℃ ，隨后全部恢復(fù)正常。對(duì)照組中的４頭攻毒豬于攻毒后２～５ｄ時(shí)出現(xiàn)體溫升高（40～41℃ ），精神不佳，食欲減退和呼吸困難等癥狀，至試驗(yàn)結(jié)束無(wú)死亡，隨機(jī)剖檢２頭，均可見心包有少量積液、腦部輕度充血等，其余未攻毒的４頭豬在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)體溫始終保持正常范圍。PCR-2 滅活苗組和 PCR-2 商品苗組在整個(gè)攻毒期內(nèi)試驗(yàn)豬均未出現(xiàn) PCVＤ 的臨床特征，攻毒后第 １ 周體溫均未超過 39.5 ℃，第２ 周均有 ２ｄ 體溫超過 39.5℃ ，第３周全部恢復(fù)正常。對(duì)照組的４頭攻毒豬于攻毒后12ｄ時(shí)開始出現(xiàn)體溫升高（40℃左右），漸進(jìn)性消瘦，皮膚蒼白，腹股溝淋巴結(jié)腫大等，第16天死亡１頭，其余至試驗(yàn)結(jié)束無(wú)死亡。隨機(jī)剖檢２頭可見全身淋巴結(jié)水腫；間質(zhì)性肺炎，呈棕黃色或棕紅色斑駁狀；心臟變形，質(zhì)地柔軟；腎腫脹，有灰白色壞死；脾腫大變形等。其余未攻毒的４頭豬在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)體溫始終保持正常范圍。二聯(lián) 苗 組 在 整 個(gè) 攻 毒 期 內(nèi) 試 驗(yàn) 豬 均 未 出 現(xiàn)ＥＭＣ和PCVＤ的臨床特征，攻毒后第１周體溫均未超過39.5℃ ，第３周有２ｄ體溫超過39.5 ℃ ，隨后全部恢復(fù)正常。對(duì)照組的４頭攻毒豬于攻毒１ｄ時(shí)出現(xiàn)體溫升高（41℃左右），精神極度沉郁，食欲廢絕，呼吸困難，麻痹，7ｄ時(shí)死亡３頭，另１頭存活至試驗(yàn)結(jié)束，但瀕臨死亡，剖檢后均發(fā)現(xiàn)心肌嚴(yán)重變性，心包積液；腦部明顯充血；脾腫大，并有鋸齒樣出血斑點(diǎn)；腎土黃色、有大面積灰白色壞死；全身淋巴結(jié)水腫等。其余未攻毒的４頭豬在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)體溫始終保持正常范圍。

３、 討論

優(yōu)秀種毒的篩選和培育對(duì)于研發(fā)高效、安全的滅活 疫 苗 至 關(guān) 重 要。 本 試 驗(yàn) 選 用 TCID 50 高 達(dá)10－9.66/0.1 ｍＬ 的 良 種 豬 源 EMCV 河 南 流 行 株JZ1201進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)條件，確定TCID 50為10－4.0/0.1ｍＬ 、 6ｍＬ培養(yǎng)液和接毒后20～24ｈ分別是最佳接種劑量、最佳培養(yǎng)液用量和最佳收毒時(shí)間，從而為研制 EMCV 高效疫苗奠定了基礎(chǔ)。

疫苗質(zhì)量與有效抗原的含量密切相關(guān)。 PCR-2體外增殖能力較差，難以獲得高毒價(jià)的病毒液而成為疫苗研發(fā)的主要瓶頸，病毒濃縮技術(shù)則不失為一種很好的選擇，如蘇金存將PCV－２細(xì)胞培養(yǎng)物通過中空纖維超濾膜組件濃縮10倍以上，使得抗原含量提高１個(gè)滴度。但迄今為止，將病毒濃縮技術(shù)應(yīng)用于 EMCV 疫苗的研究尚未見報(bào)道。為保證足夠的抗原含量，本試驗(yàn)嘗試應(yīng)用透析袋法對(duì)種病毒液進(jìn)行 ２ 倍濃縮，研制出 EMCV/PCR-2 二聯(lián)滅活疫苗。該疫苗免疫小鼠時(shí)的最佳接種劑量為 0.1ｍＬ ，首免和二免的保護(hù)率分別高達(dá) 80％ 和 100％ ，免疫效果均高于相應(yīng)單苗，并可產(chǎn)生各自的高水平抗體，彼此間不存在相互干擾作用。免疫仔豬時(shí)的最佳接種劑量為 ２ｍＬ ，二免４周后的 EMCV 中和抗體和PCR-2 ELISA 抗體均維持在高水平，整體上略高于相應(yīng)單苗和 PCR-2商品苗，且平均日增重最高，料肉比最低，攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明可完全有效抵抗EMCV 和PCR-2強(qiáng)毒株的攻擊。值得注意的是，透析袋法是利用 PEG20000的高吸濕性吸收水分來(lái)進(jìn)行濃縮，操作簡(jiǎn)便，但產(chǎn)量較低，濃縮過程緩慢，因此多用于試驗(yàn)性研究，在疫苗實(shí)際生產(chǎn)過程中可能需要利用大型濃縮裝置，在 EMCV 上的濃縮效果是否良好，有待于進(jìn)一步研究。

近年來(lái)，隨著 PCR-2疫苗的大面積推廣應(yīng)用，使得該病的危害顯著降低，豬場(chǎng)的免疫接種率逐年提高。但多年來(lái)， EMCV 在養(yǎng)豬生產(chǎn)中多表現(xiàn)為亞臨床感染，實(shí)際危害性尚不突出，因而并未受到公共衛(wèi)生界和獸醫(yī)界的高度重視，盡管國(guó)外早已成功研制出 EMC 疫苗，但在生產(chǎn)中并未得到廣泛推廣應(yīng)用。值得警惕的是，該病是一種具有自然疫源性的人獸共患疫病，對(duì)人類健康始終存在潛在的威脅，加之當(dāng)前我國(guó)豬群中的EMCV 感染日益趨于嚴(yán)重，應(yīng)加快高效疫苗的研制和推廣。本試驗(yàn)所研制的 EM-CV /PCR-2二聯(lián)滅活疫苗則為２種疾病的聯(lián)合免疫提供了可能，免疫效果也優(yōu)于各自單苗，在不需調(diào)整免疫程序，不需增加免疫應(yīng)激和疫苗成本，可達(dá)到“一針防兩病”的效果，滿足了當(dāng)前養(yǎng)豬生產(chǎn)中對(duì)EMCV免疫的潛在需求。