本著接地氣的原則，筆者嘗試著對(duì)非洲豬瘟的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，主要是熒光定量PCR技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，展開分析討論，供ASF防控參與者一同交流。商品化試劑盒常常做為技術(shù)的載體出現(xiàn)，這里不做任何廠家試劑盒的廣告，僅從技術(shù)角度分析討論。在討論診斷技術(shù)之前，筆者提出ASF商品化試劑盒的選擇原則。

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試劑盒選擇原則

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敏感性比特異性更重要

去年8月3日沈陽(yáng)非洲豬瘟疫情確診之前，我國(guó)并不是ASF疫區(qū)，根除非洲豬瘟病毒的過(guò)程中，診斷技術(shù)敏感性與特異性不能兼顧的情況下，敏感性比特異性顯得更加重要。用ELISA方法檢測(cè)ASFV抗體時(shí)，間接ELISA較阻斷ELISA的敏感性有優(yōu)勢(shì)。OIE官方建立的方法，也是間接ELISA（OIE Terrestrial Manual 2012;Chapter2.8.1）。有條件的話，可以采用間接ELISA篩選，阻斷ELISA復(fù)核。

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得到非洲豬瘟的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果后，陽(yáng)性結(jié)果必然一下子戳中神經(jīng)，震撼不已，對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果必然會(huì)進(jìn)行復(fù)核。倘若是假陽(yáng)性，便是虛驚一場(chǎng)。反而陰性結(jié)果常常直接略過(guò)，不被重視，若此結(jié)果是假陰性，那后果將是災(zāi)難性的。

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qPCR和ELISA是非常成熟的技術(shù)，商品化試劑盒的方法建立難度不大，而用大量臨床樣品、田間樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)商品化試劑盒驗(yàn)證與質(zhì)控的過(guò)程，能夠體現(xiàn)出嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度。國(guó)內(nèi)首發(fā)非洲豬瘟疫情之前并非疫區(qū)，無(wú)法收集到陽(yáng)性樣品，自主研發(fā)的商品化試劑盒的驗(yàn)證存在現(xiàn)實(shí)困難。不過(guò)日前農(nóng)業(yè)部公布的兩批非瘟試劑盒應(yīng)該經(jīng)過(guò)了驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)室可以放心使用。重磅！肇慶大華農(nóng)通過(guò)第二次非洲豬瘟現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑評(píng)價(jià)

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熒光定量PCR

筆者認(rèn)為選擇經(jīng)OIE參考室驗(yàn)證的商品化試劑盒用于ASF監(jiān)測(cè)排查，盡快掌握國(guó)內(nèi)ASF疫情，快速處置，對(duì)ASF根除是有利的。部分商品化試劑盒在歐非等傳統(tǒng)ASF疫區(qū)普遍使用，產(chǎn)品成熟而可靠。

若采取統(tǒng)一“度量衡”，以便于全國(guó)檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)的橫向比對(duì)。采用OIE推薦的非洲豬瘟病毒擴(kuò)增p72基因分型的通用型引物（p72-D/p72-U），開展監(jiān)測(cè)排查具有現(xiàn)實(shí)可行性。導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的因素很多，假陽(yáng)性的原因自查后會(huì)發(fā)現(xiàn)，而如何避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，是在檢測(cè)工作開始之前需要認(rèn)真考慮的事情。qPCR檢測(cè)結(jié)果的價(jià)值取決于所用試劑的質(zhì)量，除了引物以外，還需要提取試劑、預(yù)混液、對(duì)照試劑等。

1提供有效的檢測(cè)樣品是前提

《非洲豬瘟現(xiàn)場(chǎng)排查手冊(cè)》對(duì)樣品的采集、包裝與運(yùn)輸做出了詳細(xì)說(shuō)明，推薦使用“三重包裝系統(tǒng)”，運(yùn)送的樣品必須附有做夠的冷卻材料（如冰袋），以防變質(zhì)。確保送達(dá)實(shí)驗(yàn)室的待測(cè)樣品是有效的，是開展檢測(cè)工作的前提。實(shí)際基層采樣工作中，低溫保存和運(yùn)輸是存在現(xiàn)實(shí)困難的。在這一方面OIE參考實(shí)驗(yàn)室德國(guó)FLI實(shí)驗(yàn)室（Friedrich-Loeffler-Institute）做了很好的嘗試，采用GenoTube拭子采樣管做為采樣工具，常溫運(yùn)輸和保存送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，開展qPCR核酸檢測(cè)，ELISA和膠體金檢測(cè)卡抗體檢測(cè)。更欣喜的是FLI對(duì)非洲豬瘟的樣品采集進(jìn)行了驗(yàn)證。

2建立更嚴(yán)謹(jǐn)而合理的檢測(cè)體系 設(shè)立內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照（IPC） 有效預(yù)防假陰性結(jié)果出現(xiàn)

國(guó)內(nèi)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室qPCR檢測(cè)中會(huì)設(shè)立陰性對(duì)照和外部陽(yáng)性對(duì)照，但卻很少設(shè)立內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照（IPC）。Xeno IPC其實(shí)就是與所有物種基因組無(wú)交叉的核酸序列，被檢測(cè)樣品結(jié)果陰性，Xeno IPC檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性（Ct值預(yù)期范圍是已知），有效證明無(wú)qPCR抑制劑存在，從而降低了假陰性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)ASF這類重大動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)具有重要的意義。美國(guó)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)診斷協(xié)會(huì)（AAVLD）在實(shí)驗(yàn)室指南中明確推薦Xeno IPC在qPCR檢測(cè)過(guò)程中使用。

3選擇高品質(zhì)的核酸提取試劑和預(yù)混液

PCR檢測(cè)結(jié)果的價(jià)值取決于所用試劑的質(zhì)量。核酸提取試劑盒必須是通用型樣品制備試劑盒，可滿足實(shí)驗(yàn)室對(duì)多種樣品類型檢測(cè)需求，并對(duì)全血、脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體和環(huán)境樣品等進(jìn)行過(guò)驗(yàn)證。模塊化技術(shù)經(jīng)過(guò)專門優(yōu)化，能夠從最廣泛的樣品類型之中純化核酸，具有高簡(jiǎn)便性、性能一致性并節(jié)省時(shí)間和成本，從而幫助提高實(shí)驗(yàn)室的效率。預(yù)混液要求對(duì)酶進(jìn)行優(yōu)化，以幫助鑒定那些最重要的動(dòng)物病原體靶標(biāo)，嚴(yán)格開發(fā)的試劑穩(wěn)定且一致，即使用于最具挑戰(zhàn)性的動(dòng)物樣品，在PCR抑制劑存在的條件下也依然有效。簡(jiǎn)單易用的預(yù)混液都能幫助獲得值得信賴的結(jié)果。

4環(huán)境樣品的檢測(cè)結(jié)果反應(yīng)生物安全防護(hù)措施是否得當(dāng)

做好生物安全防護(hù)措施才能有效預(yù)防非洲豬瘟的傳入已成為共識(shí)，問題來(lái)了，如何證明生物安全防護(hù)措施是否得當(dāng)？構(gòu)建完善的生物安全監(jiān)控網(wǎng)絡(luò)，有計(jì)劃的采集動(dòng)物體和環(huán)境樣品進(jìn)行qPCR檢測(cè)，通過(guò)客觀數(shù)據(jù)足以量化生物安全措施的防護(hù)程度。尤其是針對(duì)豬場(chǎng)交叉區(qū)域的出豬臺(tái)、賣豬車、無(wú)害化處理車、員工澡堂地面等區(qū)域環(huán)境樣品的檢測(cè)。

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ELISA檢測(cè)技術(shù)

在《我國(guó)首例非洲豬瘟的確診》（王清華等）中指出，在非洲豬瘟確診的遼寧省沈陽(yáng)市沈北區(qū)采集的2頭病死豬及同群30頭臨床健康豬血清，“對(duì)32份血清樣品的ASFV特異性抗體檢測(cè)結(jié)果均為陰性。” 通常感染了強(qiáng)毒力ASFV的豬只不產(chǎn)生抗體，感染了低致病力或非致死性毒株的豬產(chǎn)生高水平的抗體。急性或最急性死亡，病死率幾乎100%是目前我國(guó)流行的非洲豬瘟疫情的顯著特點(diǎn)，感染豬只未產(chǎn)生ASFV抗體已經(jīng)死亡，因此很多人認(rèn)為在當(dāng)前疫情的情況下，開展血清學(xué)抗體檢測(cè)是無(wú)意義的，在此筆者嘗試著推敲當(dāng)前疫情下ASFV抗體檢測(cè)意義。

筆者認(rèn)為ELISA抗體檢測(cè)存在以下意義：

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《OIE陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》強(qiáng)調(diào)：“在呈地方性流行或由低毒力毒株引起的初次爆發(fā)的地方，對(duì)于新暴發(fā)病的調(diào)查研究應(yīng)包括應(yīng)用ELISA檢測(cè)血清或組織提取物中的特異性抗體；血清學(xué)方法在輔助確定ASF暴發(fā)時(shí)的作用不可低估，因?yàn)樵诩毙运劳龅牟±幸部梢詸z出抗體?！?

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及時(shí)發(fā)現(xiàn)新傳入毒株或弱毒株 全面揭示ASF疫情狀況

我國(guó)首例確診非洲豬瘟病毒株為格魯吉亞毒株（Georgia 2007），病死率100%，應(yīng)該屬于強(qiáng)毒力毒株。但同時(shí)該毒株從東歐傳入俄羅斯，又傳入遠(yuǎn)東地區(qū)傳入中國(guó)，相比較而已，弱毒力毒株具有一定的隱蔽性，更有利于其長(zhǎng)距離的傳播。從這一點(diǎn)上來(lái)看，傳入我國(guó)的ASFV格魯吉亞毒株可能也具備一定的隱蔽性。另外，已經(jīng)明確了23種基因型（Boshoof等，2007），報(bào)道的來(lái)自不同區(qū)域的毒株超過(guò)58株。其他基因型或毒株并不會(huì)靜候在國(guó)門之外，強(qiáng)弱毒株都有出入的風(fēng)險(xiǎn)存在。

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及時(shí)發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟病毒變異后引起的豬場(chǎng)感染

1921年非洲豬瘟在肯尼亞第一次報(bào)道，家豬的死亡率為100%（Montgomery,1921）。2010年從不同地區(qū)和宿主（家豬、疣豬、扁虱）上分離得到的11株非洲和歐洲ASFV分離株，毒力大小各不相同，在基因組水平也呈現(xiàn)顯著的遺傳差異（De Villlier等，2010）。我國(guó)養(yǎng)豬過(guò)程中疫苗免疫種類多大劑量，豬體內(nèi)抗體種類多，存在其他疫病抗體與ASFV交叉反應(yīng)，以及干擾素等非特異性免疫應(yīng)答的可能性，這可能導(dǎo)致ASFV感染豬病程增長(zhǎng)，甚至產(chǎn)生抗體。若ASF在國(guó)內(nèi)出現(xiàn)大規(guī)模流行，也可能出現(xiàn)病毒馴化的情況。較qPCR的抗原檢測(cè)，ELISA抗體檢測(cè)能夠幫助豬場(chǎng)及時(shí)發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟病毒變異后的感染。

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家豬和野豬都是ASFV等天然宿主，其中有三種非洲野豬可以隱性帶毒，成為病毒儲(chǔ)存器，這三種野豬是疣豬（Phacochoerus aethiopicus）、大林豬（Hylochoerus meinertzhageni）和非洲野豬（Potamochoerus porcus）（De Tray，1957）。我國(guó)除了野豬，還有眾多的地方豬品種，很有可能存在眾多對(duì)來(lái)勢(shì)洶洶的ASFV不當(dāng)回事，隱性帶毒的動(dòng)物存在。這一問題如果不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)，后患無(wú)窮。

綜上所述，我認(rèn)為ASFV抗體檢測(cè)的意義在于：

抗體陽(yáng)性結(jié)果具有明確的診斷意義，抗體陰性結(jié)果不能說(shuō)明任何問題，需正確看待。

抗體檢測(cè)在當(dāng)前會(huì)為我們揭示更全面的ASF疫情，在ASF根除過(guò)程中幫助我們及時(shí)發(fā)現(xiàn)疫情的變化。

目前進(jìn)口的商品化ELISA抗體檢測(cè)試劑盒并不多，以下品牌的ELISA試劑盒都經(jīng)歐盟非洲豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室（同時(shí)也是OIE和FAO非洲豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室）西班牙CISA-INIA實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，可以查詢對(duì)應(yīng)的驗(yàn)證結(jié)果，可網(wǎng)上自行查詢選擇。

CISA-INIA指出，在ASF呈地方流行的區(qū)域，確診可疑病例最好用標(biāo)準(zhǔn)的血清學(xué)試驗(yàn)（ELISA），結(jié)合另一種血清學(xué)試驗(yàn)（IFA）或抗原檢測(cè)試驗(yàn)（FAT）。在有些國(guó)家，95%以上的陽(yáng)性病例用IFA和FAT結(jié)合方法鑒定。IFA和FAT技術(shù)目前在國(guó)內(nèi)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室普及度很低，建議多結(jié)合qPCR核酸檢測(cè)結(jié)果診斷。

（資料來(lái)源：獸醫(yī)獸診斷試劑，編者有刪減）

致謝

感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)周磊教授，杭州貝爾塔獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室李龍博士，美國(guó)賽默飛世爾科技公司翁立楠女士，在本文寫作過(guò)程中給予的寶貴意見。