團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CVMA 5—2018

非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法

Real-time PCR assay for detection ofAfrican swine fever virus

中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布

前言

• 本標(biāo)準(zhǔn)按 GB/T 1.1-2009給出的規(guī)則起草。
• 本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)提出并歸口。
• 本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所、北京海關(guān)。
• 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：倪建強(qiáng)、王傳彬、王琴、仇華吉、殷宏、楊林、辛盛鵬、劉艷華、劉洋、宋曉暉、趙啟祖、羅玉子、劉志杰、張乾義、喬彩霞、夏應(yīng)菊、楊吉飛、徐璐、顧小雪、亢文華、李碩、畢一鳴。

非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法

1、范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的試劑、儀器和耗材、操作步驟、結(jié)果判定、實(shí)驗(yàn)室生物安全等技術(shù)要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬脾臟、淋巴結(jié)、血液等組織和血粉中非洲豬瘟病毒核酸的檢測(cè)。

2、規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB 19489 實(shí)驗(yàn)室 生物安全通用要求

NY/T 541 獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范

3、試劑

3.1DNA提取試劑

DNA提取試劑的配制見(jiàn)附錄A，或選取商品化的病毒DNA提取試劑盒并參照說(shuō)明書進(jìn)行DNA提取。

3.2 2 × PCR緩沖液

2 × PCR緩沖液的配制見(jiàn)附錄A。

3.3引物探針

3.3.1采用針對(duì)非洲豬瘟病毒VP72基因（核苷酸序列見(jiàn)附錄B）的引物及探針：

上游引物ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'

下游引物ASF-CADC-rPCRR：5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'

熒光探針ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-1653-3'

3.3.2可以使用世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）在陸生動(dòng)物診斷技術(shù)和疫苗手冊(cè)（Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals）第2.8.1章African Swine Fever中提供的引物和探針，并按照手冊(cè)中規(guī)定的檢測(cè)程序和判定標(biāo)準(zhǔn)操作：

上游引物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3'

下游引物ASF-OIE-rPCRR：

5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3'

熒光探針ASF-OIE-Probe：

5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'

3.3.3使用國(guó)家農(nóng)業(yè)行政主管部門批準(zhǔn)的其他引物、探針，應(yīng)對(duì)檢測(cè)程序和判定標(biāo)準(zhǔn)作相應(yīng)調(diào)整。

3.4 陰性及陽(yáng)性對(duì)照

陰性及陽(yáng)性對(duì)照的制備方法見(jiàn)附錄C。

3.5 其他試劑

消毒液、5U/μLTaq DNA聚合酶、無(wú)菌無(wú)核酸酶水、0.01mol/L PBS（pH7.2）。

消毒液配制見(jiàn)附錄A， 0.01mol/L PBS配制見(jiàn)附錄A。

4、儀器和耗材

分析天平（感量0.1mg）、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（最高離心速度不低于12 000r/min）、冰盒、實(shí)時(shí)熒光PCR儀及配套反應(yīng)管（板）、組織研磨器、-20℃冰箱、可調(diào)移液器（2 μL，20 μL，200μL，1 000 μL）、1.5mL離心管（無(wú)核酸酶）。

5、操作步驟

5.1 樣品采集及運(yùn)輸

樣品采集及運(yùn)輸按照NY/T541的規(guī)定執(zhí)行，采集豬的脾臟、淋巴結(jié)、血液等組織材料或血粉用于檢測(cè)，樣品應(yīng)在冷藏條件下盡快運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，避免反復(fù)凍融。采樣時(shí)應(yīng)穿戴個(gè)人生物安全防護(hù)裝備，實(shí)施現(xiàn)場(chǎng)消毒和廢棄物處理。

5.2 樣品處理

檢測(cè)前樣品應(yīng)在二級(jí)生物安全柜中處理。取0.1g～0.2g組織或血粉，經(jīng)研磨破碎后加1mL的0.01mol/L PBS（pH7.2）制成勻漿，經(jīng)12 000 r/min離心2Min取上清；全血、血清樣品直接取1mL，置于1.5 mL離心管內(nèi)蓋緊管帽。將上述處理的樣品置于60℃條件下滅活30min。

5.3 樣品保存

采集或處理好的樣品在2℃～8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)24 h；如需長(zhǎng)期保存，應(yīng)放置-70℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過(guò)3次）。

5.4 病毒DNA提取

5.4.1 DNA提取應(yīng)在樣本制備區(qū)內(nèi)采用以下方法進(jìn)行，若使用其他等效的病毒DNA提取試劑，則按照試劑說(shuō)明書操作。

5.4.2 待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的份數(shù)總和用n表示，取n個(gè)滅菌1.5 mL離心管，逐管編號(hào)。

5.4.3 每管加入200μL DNA提取液1，然后分別加入待測(cè)樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各200μL，1份樣品換用1個(gè)吸頭，混勻器上震蕩混勻5s。于4℃～25℃條件下，13 000 r/min離心10 min。DNA提取液1見(jiàn)附錄A。

5.4.4 盡可能吸取上清、棄去，吸頭不要碰到沉淀，再加入10 μL DNA提取液2，混勻器上震蕩混勻5 s。于4℃～25℃條件下，2 000 r/min離心10s。DNA提取液2見(jiàn)附錄A。

5.4.5 100℃干浴或沸水浴10 min。

5.4.6 加入90μL無(wú)DNA酶的滅菌去離子水，13 000 r/min離心10 min，上清即為提取的DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩o(wú)DNA酶的滅菌去離子水見(jiàn)附錄A。

5.5 實(shí)時(shí)熒光PCR操作

5.5.1 在反應(yīng)混合物配制區(qū)、樣品制備區(qū)和檢測(cè)區(qū)分別進(jìn)行5.5.2～5.5.4。

5.5.2 每個(gè)檢測(cè)反應(yīng)體系需使用20μL實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液。根據(jù)5.4.2中設(shè)定的n值，按附錄D配制反應(yīng)液，充分混勻后分裝，每個(gè)PCR反應(yīng)管20μL。轉(zhuǎn)移PCR反應(yīng)管至樣品制備區(qū)。

5.5.3 在上述5.5.2的反應(yīng)管中分別加入5.4中提取的DNA溶液5μL，使每管總體積達(dá)到25 μL，記錄反應(yīng)管對(duì)應(yīng)的樣品編號(hào)。蓋緊管蓋后，瞬時(shí)離心。

5.5.4 將5.5.3加樣后的反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)儀內(nèi)，記錄反應(yīng)管擺放順序。選定5-羧基熒光素（FAM）作為報(bào)告基團(tuán)，小溝結(jié)合物（MGB）為淬滅基團(tuán)，反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下：預(yù)變性95℃/3 min；95℃/15 s，52℃/10 s，60℃/35 s，45個(gè)循環(huán)；在每次循環(huán)的60℃退火延伸時(shí)收集熒光。試驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)收集的Ct值和熒光曲線判定結(jié)果。

6、結(jié)果判定

6.1 結(jié)果分析條件設(shè)定

實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)閾值設(shè)定原則：閾值線超過(guò)陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，且相交于陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增曲線進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期的拐點(diǎn)，或根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整。每個(gè)樣品反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值。

6.2 結(jié)果描述及判定

當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照Ct值≤28.0且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無(wú)Ct值無(wú)擴(kuò)增曲線時(shí)，實(shí)驗(yàn)成立，實(shí)例參考附錄E。當(dāng)被檢樣品出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線且Ct值≤38.0時(shí)，判為非洲豬瘟病毒核酸陽(yáng)性；被檢樣品無(wú)Ct值，判為非洲豬瘟病毒核酸陰性；對(duì)于Ct值＞38.0的樣品且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，應(yīng)重檢，重檢仍出現(xiàn)上述結(jié)果的判為陽(yáng)性，否則判為陰性。

7、實(shí)驗(yàn)室生物安全要求

7.1 本方法涉及非洲豬瘟感染性樣品的實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在（動(dòng)物）生物安全三級(jí)試驗(yàn)室中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室生物安全管理要求見(jiàn)GB 19489。國(guó)家農(nóng)業(yè)行政主管部門另有規(guī)定的，按其規(guī)定執(zhí)行。

7.2 使用過(guò)的實(shí)驗(yàn)器材和液體廢棄物應(yīng)先經(jīng)過(guò)消毒液浸泡處理，再經(jīng)高溫高壓處理后廢棄。剩余樣品等固體廢棄物應(yīng)在生物安全柜中密封包裝，經(jīng)表面消毒后移出，再經(jīng)高溫高壓處理后廢棄。

一

附錄 A(規(guī)范性附錄) 試劑的配制

A.1 DNA提取液1

PEG8000晶體20.74g，NaCL17.53g，加去離子水定容到100 mL。

A.2 DNA提取液2

1mol/LTris.Hcl 2 mL，2 mol/L KCL5 mL，0.5 mol/L EDTA 0.5 mL，NP-40 1 mL，加去離子水定容到100 mL。

即KCL14.912g，Tris堿12.114g，1.2068 mL濃HCl，EDTA14.612g，NaOH 6g, 加去離子水定容到100 mL。

A.3 2×PCR緩沖液

滅菌去離子水 70 mL

三羥甲基氨基甲烷（Tri s） 0.79 g

氯化鉀 1.865 g

曲拉通X-100 0.5 mL

dATP (100mmol/L) 2.5 mL

dTTP (100mmol/L) 2.5 mL

dGTP (100mmol/L) 2.5 mL

dCTP (100mmol/L) 2.5 mL

六水氯化鎂 0.61 g

鹽酸 調(diào)pH至9.0

滅菌去離子水 加至100 mL

A.4 消毒液

8‰氫氧化鈉或3‰福爾馬林或3%鄰苯基苯酚或碘化合物等其他消毒試劑均可。

A.5 磷酸鹽緩沖液（PBS）的配方

A.5.1 A液

0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液：NaH2PO4·H2O 27.6 g，溶于蒸餾水中，最后定容至1 000 mL。

A.5.2 B液

0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液：Na2HPO4·7H2O 53.6 g（或Na2HPO4·12H2O 71.6 g或Na2HPO4·2H2O 35.6 g），加蒸餾水溶解，最后定容至1 000 mL。

A.5.3 0.01 mol/L、pH 7.2 磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制

取A液14 mL、B液36 mL，加NaCl 8.5 g，用蒸餾水定容至1 000 mL。經(jīng)過(guò)濾除菌后，無(wú)菌條件下分裝。

A.6 無(wú)DNA酶的滅菌去離子水

無(wú)DNA酶的滅菌去離子水是用1 %DEPC處理后的去離子水，電阻應(yīng)該大于18.2mΩ。

二

附錄B（資料性附錄）非洲豬瘟病毒VP72基因參考序列

• 1ATGGCATCAG GAGGAGCTTT TTGTCTTATT GCTAACGATG GGAAGGCCGA CAAGATTATA
• 61TTGGCCCAAG ACTTGCTGAA TAGCAGGATC TCTAACATTA AAAATGTGAA CAAAAGTTAT
• 121GGGAAACCCG ATCCCGAACC CACTTTGAGT CAAATCGAAG AAACACATTT GGTGCATTTT
• 181AATGCGCATT TTAAGCCTTA TGTTCCAGTA GGGTTTGAAT ACAATAAAGT ACGCCCGCAT
• 241ACGGGTACCC CCACCTTGGG AAACAAGCTT ACCTTTGGTA TTCCCCAGTA CGGAGACTTT
• 301TTCCATGATA TGGTGGGCCA TCATATATTG GGTGCATGTC ATTCATCCTG GCAGGATGCT
• 361CCGATTCAGG GCACGTCCCA GATGGGGGCC CATGGGCAGC TTCAAACGTT TCCTCGCAAC
• 421GGATATGACT GGGACAACCA AACACCCTTA GAGGGCGCCG TTTACACGCT TGTAGATCCT
• 481TTTGGAAGAC CCATTGTACC CGGCACAAAG AATGCGTACC GAAACTTGGT TTACTACTGC
• 541GAATACCCCG GAGAACGACT TTATGAAAAC GTAAGATTCG ATGTAAATGG AAATTCCCTA
• 601GACGAATATA GTTCGGATGT CACAACGCTT GTGCGCAAAT TTTGCATCCC AGGGGATAAA
• 661ATGACTGGAT ATAAGCACTT GGTTGGCCAG GAGGTATCGG TGGAGGGAAC CAGTGGCCCT
• 721CTCCTATGCA ACATTCATGA TTTGCACAAG CCGCACCAAA GCAAACCTAT TCTTACCGAT
• 781GAAAATGATA CGCAGCGAAC GTGTAGCCAT ACCAACCCGA AATTTCTTTC ACAGCATTTT
• 841CCCGAGAACT CTCACAATAT CCAAACAGCA GGTAAACAAG ATATTACTCC TATCACGGAC
• 901GCAACGTATC TGGACATAAG ACGTAATGTT CATTACAGCT GTAATGGACC TCAAACCCCT
• 961AAATACTATC AGCCCCCTCT TGCGCTCTGG ATTAAGTTGC GCTTTTGGTT TAATGAGAAC
• 1021GTGAACCTTG CTATTCCCTC AGTATCCATT CCCTTCGGCG AGCGCTTTAT CACCATAAAG
• 1081CTTGCATCGC AAAAGGATTT GGTGAATGAA TTTCCTGGAC TTTTTGTACG CCAGTCACGT
• 1141TTTATAGCTG GACGCCCCAG TAGACGCAAT ATACGCTTTA AACCATGGTT TATCCCAGGA
• 1201GTCATTAATG AAATCTCGCT CACGAATAAT GAACTTTACA TCAATAACCT GTTTGTAACC
• 1261CCTGAAATAC ACAACCTTTT TGTAAAACGC GTTCGCTTTT CGCTGATACG TGTCCATAAA
• 1321ACGCAGGTGA CCCACACCAA CAATAACCAC CACGATGAAA AACTAATGTC TGCTCTTAAA
• 1381TGGCCCATTG AATATATGTT TATAGGATTA AAACCTACCT GGAACATCTC CGATCAAAAT
• 1441CCTCATCAAC ACCGAGATTG GCACAAGTTC GGACATGTTG TTAACGCCAT TATGCAGCCC
• 1501ACTCACCACG CAGAGATAAG CTTTCAGGAT AGAGATACAG CTCTTCCAGA CGCATGTTCA
• 1561TCTATATCTG ATATTAGCCC CGTTACGTAT CCGATCACAT TACCTATTAT TAAAAACATT
• 1621TCCGTAACTG CTCATGGTAT CAATCTTATC GATAAATTTC CATCAAAGTT CTGCAGCTCT
• 1681TACATACCCT TCCACTACGG AGGCAATGCG ATTAAAACCC CCGATGATCC GGGTGCGATG
• 1741ATGATTACCT TTGCTTTGAA GCCACGGGAG GAATACCAAC CCAGTGGTCA TATTAACGTA
• 1801TCCAGAGCAA GAGAATTTTA TATTAGTTGG GACACGGATT ACGTGGGGTC TATCACTACG
• 1861GCTGATCTTG TGGTATCGGC ATCTGCT

三

附錄C（規(guī)范性附錄）非洲豬瘟病毒核酸陽(yáng)性及陰性對(duì)照

C.1陽(yáng)性對(duì)照

陽(yáng)性對(duì)照制備方法：人工合成非洲豬瘟病毒VP72基因片段，序列參見(jiàn)附錄B，將VP72基因連接于pMD20-T載體制成陽(yáng)性質(zhì)粒pMD20-T-VP72，使用非洲豬瘟病毒陰性豬的組織研磨液將質(zhì)粒稀釋至濃度為10 000copies/?L，保存于-20℃?zhèn)溆谩?

C.2 陰性對(duì)照

陰性對(duì)照為非洲豬瘟病毒陰性豬的組織研磨液。

四

附錄D（規(guī)范性附錄）實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液配方

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液配方見(jiàn)表D.1。

表D.1 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液配方

五

附錄 E（資料性附錄）非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增實(shí)例參考

圖D.1給出了非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增實(shí)例。

圖E.1 非洲豬瘟病毒核酸實(shí)時(shí)熒光PCR典型擴(kuò)增曲線示意圖

(資料來(lái)源：中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)）