ASF 的準(zhǔn)確、快速診斷對(duì)于防止 ASF 蔓延、快速撲滅和根除尤其重要。ASFV 自然感染的潛伏期大約為 4—19天 (Wardley et al., 1983)，感染后 7-10 天可檢測(cè)到抗體。一個(gè)地區(qū)或豬場(chǎng)首次暴發(fā) ASF 時(shí)呈最急性、急性感染臨床癥狀，感染豬只表現(xiàn)為急性出血、死亡，由于首次暴發(fā)時(shí)發(fā)病豬只在抗體出現(xiàn)前就已經(jīng)死亡，此時(shí)首選抗原檢測(cè)方法。隨著病毒循環(huán)和擴(kuò)散，其毒力會(huì)下降，感染豬只表現(xiàn)為亞急性和慢性感染臨床癥狀 (Bech-Nielsen et al., 1995;Penrith et al., 2004; Wardley et al., 1983)，此時(shí)抗體檢測(cè)更適用于疫情的監(jiān)測(cè)和 ASF 根除計(jì)劃。

來源：中國獸醫(yī)協(xié)會(huì) 勃林格殷格翰（中國）動(dòng)物保健

一、臨床診斷

ASF的臨床癥狀和許多其他豬的疾病很相似，特別是豬瘟、豬丹毒和豬高致病性藍(lán)耳病等。鑒別診斷依靠病原學(xué)或血清學(xué)診斷。ASFV 感染后，發(fā)病率一般在 40-85% 之間，死亡率由 ASFV 毒株的毒力決定。高致病性毒株死亡率可高達(dá) 90-100%;中致病性毒株在成年動(dòng)物能引起 20-40% 的死亡率，在幼年動(dòng)物中引起 70-80% 的死亡率;低致病性毒株能夠造成 10-30% 的死亡率。特急性型 ASF表現(xiàn)為突然死亡，臨床癥狀不明顯。急性癥狀表現(xiàn)為食欲減退、發(fā)熱(40-42℃)、肺水腫、淋巴組織廣泛壞死和出血、皮下出血和高死亡率 (GomezVillamandos et al., 1995b; Mebus, 1988)。亞急性或慢性 感染有時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)鼻出血、便秘、嘔吐，出血性腹瀉。在四肢、耳、胸部、腹部和會(huì)陰部位出現(xiàn)不規(guī)則的出血斑，這些癥狀在感染中等致病毒株的豬中較為明顯(圖 14，圖15)。懷孕母豬常發(fā)生流產(chǎn)。

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圖14：典型非洲豬瘟的臨床癥狀

a. 最初耳部尖端發(fā)紅;

b. 隨后全身皮膚發(fā)紅、出血。

來源：(Oura et.,2013)

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圖15：急性和亞急性非洲豬瘟臨床癥狀

a. 急性非洲豬瘟，皮下出血、壞死斑;

b. 亞急性非洲豬瘟，腿部皮膚出血點(diǎn);

c. 亞急性非洲豬瘟，肛門周圍附著出血性糞便。

來源：(Gallardo et al.,2015c)

全身臟器出血、壞死是 ASF 的主要臨床表現(xiàn)，具體表現(xiàn)為皮下出血，淋巴結(jié)廣泛出血和壞死，嚴(yán)重時(shí)呈黑色。肺水腫。脾臟腫大、質(zhì)脆變脆，腎臟、腸系膜和漿膜出血(圖 16，圖 17)。

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圖 16:急性非洲豬瘟解剖病變

A脾臟腫大，紫黑色;

B. 淋巴結(jié)嚴(yán)重出血;

C. 淋巴結(jié)切面，出血、濕潤;

D. 腎臟腫大、表面出血大量出血點(diǎn)。

來源：(Sanchez-Vizcaino et al., 2015)

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圖17：亞急性非洲豬瘟解剖病變。

A. 膽囊壁嚴(yán)重水腫;

B. 腎臟周圍水腫;

C. 脾臟部分充血、腫大 ;

D. 肝、胃淋巴結(jié)出血;

E. 腎門淋巴結(jié)出血 ;

F. 腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)、腎盂嚴(yán)重出血。

來源：(Sanchez-Vizcaino et al., 2015)

二、病原學(xué)診斷

病原學(xué)診斷依賴于活病毒、抗原、基因組的檢測(cè)，包括病毒分離、抗原ELISA、熒光抗體檢測(cè)(FAT)、PCR和等溫?cái)U(kuò)增分析等方法。目前實(shí)時(shí)熒光定量qPCR(Quantitative real-time PCR，qPCR) 使用最為廣泛，對(duì) ASFV 診斷具有很高的靈敏性和特異性。

ASFV主要在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制?？刹杉呐R床樣品包括抗凝血(EDTA)、脾臟、肝臟、淋巴結(jié)和扁桃體 (PJ, 1989)。若需病毒分離，樣品運(yùn)送過程中需保持低溫冷藏，不能冷凍。

1、病毒分離

ASFV可以從血液、脾臟、肝臟、淋巴結(jié)和扁桃體等組織中分離。紅細(xì)胞吸附(HAD)實(shí)驗(yàn)可用于 ASFV 檢測(cè)(圖18)。但是后來發(fā)現(xiàn)部分 ASFV 毒株呈現(xiàn) HAD 陰性。

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圖18：ASFV感染的巨噬細(xì)胞周圍吸附大量紅細(xì)胞。

來源：http://asf-referencelab.info/asf/en/proceduresdiagnosis/diagnostic-procedures

2、熒光抗體檢測(cè)(FAT)

用疑似感染 ASF 的豬組織制作涂片或冰凍切片，內(nèi)源性的抗原可與特異性的 AFSV 熒光抗體結(jié)合，顯微鏡直接觀察結(jié)果。優(yōu)點(diǎn)是快速、特異高，對(duì)于急性病例的診斷靈敏度較高，但對(duì)亞急性或慢性 AFS，由于自身抗體會(huì)阻斷熒光抗體與抗原的結(jié)合，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

3、抗原 ELISA

病毒抗原也可用ELISA檢測(cè)，但只推薦在急性病例時(shí)使用，靈敏度沒有PCR檢測(cè)方法高(Steiger et al.,1992)。第一個(gè)直接 ELISA 檢測(cè) ASFV 的方法能檢測(cè)的抗原濃度是 50-500 HAD50/ml (Wardley et al., 1979)。后來基于 VP72 單抗的雙抗夾心法 ELISA 具有較高的靈敏性 (Vidalet al., 1997)。分子診斷技術(shù)目前 qPCR 被認(rèn)為是 ASFV 基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，被用在 OIE 所有的區(qū)域性參考實(shí)驗(yàn)室。血液、血清和組織樣本都可用于 qPCR 檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)是快速、敏感性和特異性都很高。能夠檢測(cè)出所有 ASFV 毒株(23 個(gè)基因型)，甚至因保存不當(dāng)而降解的樣本也可用于檢測(cè) (Boshoff et al., 2007)。但容易因交叉污染出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，此外，因 PCR 抑制物及核酸降解出現(xiàn)的假陰性也應(yīng)該注意。

King首次報(bào)道TaqMan探針熒光定量PCR檢測(cè)方法 (King et al., 2003)，該方法在 OIE推薦方法，引物針對(duì) VP72 保守區(qū)域，有很高的特異性和靈敏度，針對(duì) 25 種ASFV 毒株和 16 種非洲及歐洲的軟蜱 ASFV 毒株，靈敏度達(dá)到 10-100 個(gè)核酸分子。

現(xiàn)在在使用的幾種分子診斷技術(shù)見下表 7：

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表 7：Real-time PCR, Linear-After-The-ExponentialPCR (LATE-PCR) 和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

三、血清學(xué)診斷

豬感染 ASFV 后 7-10 天可出現(xiàn)抗體，抗體可以持續(xù)很長時(shí)間，由于目前沒有 ASF 疫苗可用，因此抗體檢測(cè)可作為感染 ASFV的診斷依據(jù)，尤其是針對(duì)于亞急性和慢性ASF，適合大規(guī)?？贵w篩查。在ASF根除計(jì)劃中有很重要的作用。

ASFV 編碼多種蛋白，具有診斷意義的蛋白主要有p72，p54, p30(p32) 和 p62 蛋白。常用抗體檢測(cè)方法主要有 ELISA，間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IIF)、對(duì)流免疫電泳(IEOP)和免疫印跡 (IB) 等。最早用于 ASF 抗體檢測(cè)的是對(duì)流免疫電泳(IEOP)(Panet al., 1972)，后來被敏感性更高的 ELISA 取代，國際間貿(mào)易多用 ELISA 檢測(cè)。鑒于 ELISA 檢測(cè)容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，陽性樣本需要再次進(jìn)行 IIF 或 IB 檢測(cè)確認(rèn)。IB 可對(duì)結(jié)果作出一個(gè)簡(jiǎn)單客觀的解釋 (Alcaraz et al., 1990; Pastor et al., 1989)。

四、病理學(xué)診斷

全身多個(gè)臟器淤血、出血、壞死是 ASF 的主要臨床表現(xiàn)，大體病變見(臨床診斷部分)。組織病理學(xué)表現(xiàn)為出血、淤血，脾臟(圖19)、肝臟(圖20)、胸腺(圖21)、腸道(圖22)、肺和腦(圖23)等組織中的單核、淋巴細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、核碎裂。鑒于ASF的特殊性，需要依靠病原學(xué)和血清學(xué)進(jìn)行確診和鑒別診斷。

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圖 19：ASFV 感染豬的脾臟(A、B)和扁桃體(C、D)。測(cè)方法 靶位基因 內(nèi)參 敏感度 (拷貝數(shù))

A. 脾臟紅髓和白髓大面積出血、壞死，淋巴細(xì)胞減少; B. 殘存的淋巴組織(箭頭所指);

C-D. 淋巴細(xì)胞壞死、核碎裂。( 長箭頭指部分隱窩，短箭頭指部分濾泡)。

來源：(Ganowiak, 2012)

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圖 20：感染 ASFV 12 天后，肝臟免疫組化結(jié)果?？梢娍莘袷霞?xì)胞(棕色)周圍吸附多個(gè)紅細(xì)胞(紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，HAD)。來源：(Rodriguez et al., 1996)

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圖 21. 感染ASFV 6天后胸腺。

A. 正常胸腺對(duì)照;

B. 淋巴細(xì)胞嚴(yán)重耗竭，呈現(xiàn)星空樣。

來源：(Salguero et al., 2004)

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圖 22：急性 ASF 腸系膜淋巴結(jié)。淋巴細(xì)胞壞死、核碎裂。來源：(Ganowiak, 2012)

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圖23：感染ASEV后肺與腦組織病理變化。

A. 肺臟嚴(yán)重充血，血管因血栓堵塞而顯著擴(kuò)大(箭頭所指);

B. 腦脈絡(luò)叢血管嚴(yán)重充血，部分血管周圍出現(xiàn)單核細(xì)胞浸潤;

C-D. 腦實(shí)質(zhì)血管周圍出現(xiàn)大量單核細(xì)胞浸潤，呈“血管套” 現(xiàn)像，浸潤的單核細(xì)胞出現(xiàn)核碎裂。

來源：(Ganowiak, 2012)

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