批注：豬場圓環(huán)病毒的間接影響、造成的損失是不可小覷的。特別是在高強度免疫壓力下，圓環(huán)病毒在豬場不僅僅是PCV-2，還出現(xiàn)了PCV-3、PCV-4等毒株、亞型。相關(guān)報道，可進一步了解閱讀《PCV3貴州流行株基因組分析及其Cap蛋白的原核表達研究》、《豬圓環(huán)病毒3型衣殼蛋白(Cap)抑制宿主細胞天然免疫應(yīng)答》、《不容小覷的新型豬圓環(huán)病毒:中國部分地區(qū)PCV3分子流行病學(xué)調(diào)查》等。

摘要：

對廣東省不同地區(qū)新生仔豬先天性震顫豬群中PCV3的流行病學(xué)情況進行調(diào)查。采集的病料樣品，通過常規(guī)PCR進行PCV3檢測與全基因擴增，分析其全基因的遺傳進化關(guān)系。將獲得的16株P(guān)CV3毒株核酸序列與其他環(huán)狀病毒參考毒株對全基因組和Cap基因進行遺傳變異分析，結(jié)果顯示，新生仔豬的先天性震顫豬群中PCV3樣本總陽性率高達58.2%。16株P(guān)CV3毒株之間全基因核苷酸序列同源性為99.5%～100%，與美洲代表毒株P(guān)CV3-US/MO2015全基因核苷酸序列同源性在98.8%～99.1%之間；16株P(guān)CV3毒株之間Cap基因的核苷酸序列同源性為99.7%～100%，與國內(nèi)外參考毒株的核苷酸同源性為99.1%～100%。遺傳進化分析顯示，16株P(guān)CV3毒株都屬于PCV3a分支。PCV3在我國廣東省新生仔豬先天性震顫豬群中廣泛存在。

豬圓環(huán)病毒3型（Porcinecircovirus 3）是一種新發(fā)現(xiàn)的圓環(huán)病毒，2016年美國通過宏基因組技術(shù)從一些患有心肌炎的仔豬中檢測到一種新型的豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus,PCV），將其命名為PCV3，隨后在具有豬皮炎腎病綜合征、生殖繁殖障礙和心肌多系統(tǒng)炎癥的病豬中檢測到PCV3[1]。PCV3屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovirus），是無囊膜病毒，具有該圓環(huán)病毒科家族的環(huán)狀單鏈DNA基因組[2]。其基因組全長約為2kb，主要包括3個開放閱讀框（ORF),ORF1基因編碼的復(fù)制酶蛋白（replicase protein,Rep），主要參與病毒DNA的復(fù)制[3],ORF2基因編碼的核衣殼蛋白（capsid protein,Cap）是主要的結(jié)構(gòu)和抗原蛋白[4]，但是PCV3與PCV2的ORF2基因同源性只有37%[2],ORF3基因編碼的蛋白目前研究較少，其結(jié)構(gòu)與功能尚不清楚。自2016年以來，PCV3已在多個國家被檢測到，包括德國、意大利、中國[5,6,7]等。

先天性震顫多見于新生仔豬，其臨床特征是四肢、頭部或全身出現(xiàn)有節(jié)奏的震顫，雖然全身抖動不直接導(dǎo)致仔豬死亡，但是可以導(dǎo)致仔豬行走、吃奶困難阻礙仔豬進行哺乳，常因初乳攝入不足隨后可能導(dǎo)致嚴重的發(fā)育遲緩或饑餓死亡[8]。因此，仔豬先天性震顫對養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。在近一個世紀(jì)的過程中，仔豬先天性震顫在許多國家被報道，暗示其是一種世界性疾病[9,10,11,12,13,14]。雖然，它是在近一個世紀(jì)以前的文獻中被首次報道，大多數(shù)現(xiàn)代暴發(fā)的仔豬先天性震顫病因作用仍未定義。有文獻報道從仔豬先天性震顫中檢測出PCV3[15]，提示其與該病有密切聯(lián)系。因此，我們調(diào)查了廣東省不同地區(qū)新生仔豬先天性震顫豬群中PCV3流行情況。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑

PremixEx TaqTM酶和DNA DL2 000Maker、pMD19-T，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；病毒核酸提取試劑盒Magen RaPure Viral RNA/DNA Kit,Magen公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒，OMEGA公司產(chǎn)品。

1.1.2樣品來源

2017年2月～2018年4月收集122份樣品來源于廣東省的36個豬場。發(fā)病豬的臨床特征是四肢、頭部或全身出現(xiàn)有節(jié)奏的震顫，經(jīng)常無法吸吮母乳，導(dǎo)致其營養(yǎng)不良或饑餓致死，采集發(fā)病豬的組織樣品，包括腦、脾臟、肺臟、淋巴結(jié)和血清。

1.2方法

1.2.1病料核酸的提取

稱取各組織病料0.2g置于勻漿管中，加入不同規(guī)格的鋼珠和1mL生理鹽水后，置于組織勻漿機中勻漿30s,3個循環(huán)，勻漿后的樣品放置-80℃冰箱，反復(fù)凍融3次釋放病毒，8 000r/min低溫離心5min后獲取上清液。取250μL上清按照Magen RaPure Viral RNA/DNA Kit試劑盒說明書進行核酸的提取，置-80℃保存待用。

1.2.2引物設(shè)計與合成

參照Palinski R等[2]的研究合成1對引物用于PCV3檢測，并參考Fux R等[5]的研究合成3對引物用于PCV3全基因組擴增（表1）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 PCV3特異基因擴增引物

Table 1 Amplification primers forspecific genes of PCV3

1.2.3PCV3全基因組序列測定與分析

將PCV3陽性樣品進行全基因組序列測定，以陽性樣品核酸為模板，用表1中的3對引物參考Premix Ex TaqTM酶說明書進行片段擴增。PCV3全基因組擴增體系為50μL:2×Premix Ex Taq 25μL，上、下游引物各取1μL，去離子水21μL，提取的DNA模板2μL。擴增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min;94℃30s、55℃30s、72℃70s，共35個循環(huán)；72℃后延伸3min。PCR產(chǎn)物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4基因克隆與測序分析

選擇瓊脂糖凝膠電泳為陽性的樣品，用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，純化后克隆至pMD19-T載體，對重組質(zhì)粒進行菌液PCR鑒定，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送至深圳華大基因股份有限公司進行測序。

1.2.5PCV3全基因序列拼接及系統(tǒng)進化樹分析

將測序獲得的3段序列進行拼接，并與國內(nèi)外參考毒株序列進行比對得到PCV3全基因組序列，應(yīng)用生物學(xué)軟件DNA Star V7.1、MEGA 7.0對PCV3全基因組及Cap基因序列與參考毒株序列比對進行核苷酸同源性分析和繪制遺傳進化樹。

2結(jié)果

2.1臨床樣品PCV3的檢測

應(yīng)用常規(guī)PCR對36個豬場送檢的122份臨床樣品進DNA行檢測，結(jié)果顯示，122份樣品中的71份被鑒定為PCV3陽性，樣品總陽性率為58.2%(71/122),2017年和2018年（表2)PCV3臨床陽性樣品數(shù)分別是34份和37份，PCV3的陽性率分別為49.3%(34/69）和69.8%(37/53）。此外，在2017年21個豬場中有16個為PCV3陽性場，豬場陽性率為76.2%(16/21),2018年15個豬場中有12個為PCV3陽性場，豬場陽性率為80.0%(12/15），豬場總陽性率為77.8%(28/36）。表明廣東省地區(qū)存在PCV3感染。

2.2PCV3的PCR檢測及全基因組PCR擴增

經(jīng)常規(guī)PCR檢測出為陽性的樣品進行PCV3全基因組擴增，3段引物PCV3-1-F/R、PCV3-2-F/R、PCV3-3-F/R經(jīng)PCR擴增，產(chǎn)物大小與Fux R等[5]研究一致，分別為1 072、425、1 007bp（圖1）。將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序，用于遺傳進化分析。

表2病料樣品與豬場水平PCV3的陽性率

Table 2 Detection rates of PCV3insamples and farms

2.3 PCV3全基因組的遺傳進化分析

將本研究所獲得的16株P(guān)CV3毒株與國內(nèi)外的25株環(huán)狀病毒參考毒株序列應(yīng)用DNAStar的MegAline軟件進行核苷酸同源性分析，并應(yīng)用MEGA 7.0構(gòu)建遺傳進化樹，分析PCV3全基因組與其他環(huán)狀病毒參考毒株之間的進化關(guān)系。結(jié)果表明，16株P(guān)CV3毒株之間核苷酸序列同源性為99.5%～100%，但與PCV1、PCV2的核苷酸同源性分別在43.6%～43.9%、44.0%～44.3%之間，與美洲代表毒株P(guān)CV3-US/MO2015之間的核苷酸序列同源性為98.8%～99.1%。全基因進化樹結(jié)果表明，本研究的16株P(guān)CV3與最早發(fā)現(xiàn)的PCV3-US/2015在同一群中（圖2）。

2.4PCV3Cap基因的遺傳進化分析

本研究獲得的16株P(guān)CV3毒株之間Cap基因的核苷酸序列同源性為99.7%～100%，與國內(nèi)外參考毒株的核苷酸同源性為99.1%～100%;16株P(guān)CV3Cap基因推導(dǎo)的氨基酸序列與參考毒株同源性為99.5%～100%。基因進化樹分析表明，本研究的16個流行毒株均屬于PCV3a亞型（圖3）。

3討論

先天性震顫通常發(fā)生在新生仔豬中，其腦和脊髓表現(xiàn)出嚴重的病理損傷[8]。新生仔豬的先天性震顫在豬群中普遍存在，并對我國造成了巨大的經(jīng)濟損失[13]。自2016年在美國首次報道PCV3以來，在我國多個省也相繼出現(xiàn)PCV3感染的報道。大多數(shù)研究表明，PCV3感染與PDNS和生殖障礙有關(guān)[2]。而近年有報道稱從仔豬先天性震顫的豬群中檢測到PCV3[13]。因此，我們對廣東省不同地區(qū)新生仔豬先天性震顫豬群進行PCV3流行病學(xué)調(diào)查。

在本研究中，應(yīng)用常規(guī)PCR對臨床樣品進行PCV3檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新生仔豬先天性震顫豬群中PCV3總陽性率高達58.2%(71/122),2017年和2018年P(guān)CV3感染率分別為49.3%和69.8%，其感染率有上升的趨勢；豬場的陽性率為77.8%。PCV3可以在不同的臨床組織樣品如腦、脾臟、肺臟、淋巴結(jié)及血清等中被檢測到，其中腦和淋巴結(jié)組織中檢出率最高，脾臟次之。大多數(shù)的研究[8,9,13,16]表明仔豬的先天性震顫是由豬非典型瘟病毒（AP-PV）引起的。先天性震顫的仔豬，其腦和脊髓表現(xiàn)出嚴重的病理損傷[8]，而本研究發(fā)現(xiàn)PCV3在腦中檢出率最高，且一些樣品APPV呈陰性。這些結(jié)果表明，PCV3可能也是引起新生仔豬先天性震顫的一種病原。

此外，通過PCR獲得了16株P(guān)CV3毒株?；蚪M全序列分析結(jié)果顯示，16株P(guān)CV3與其他的PCV3毒株相似，他們的全基因組大小均為2 000kb，具有兩個反向排列的開放閱讀框（ORFs），主要編碼Cap和Rep蛋白，與之前報道的其他PCV3毒株進行比較，全基因組沒有核苷酸的插入或缺失。序列分析顯示，16株P(guān)CV3全基因及ORF2基因的核苷酸同源性分別為99.5%～100%和99.7%～100%。Cap基因遺傳進化分析結(jié)果顯示，本研究獲得的16株P(guān)CV3都分布在3a分支，說明此次從廣東地區(qū)獲得的PCV3流行毒株屬于PCV3a亞型。

總之，研究結(jié)果表明PCV3在廣東省新生仔豬先天性震顫豬群中廣泛存在，且遺傳進化分析顯示都屬于3a分支。這些結(jié)果對于更好地理解PCV3及其在新生仔豬先天性震顫豬群中的作用至關(guān)重要。

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