批注：豬場(chǎng)圓環(huán)病毒的間接影響、造成的損失是不可小覷的。特別是在高強(qiáng)度免疫壓力下，圓環(huán)病毒在豬場(chǎng)不僅僅是PCV-2，還出現(xiàn)了PCV-3、PCV-4等毒株、亞型。相關(guān)報(bào)道，可進(jìn)一步了解閱讀《PCV3貴州流行株基因組分析及其Cap蛋白的原核表達(dá)研究》、《豬圓環(huán)病毒3型衣殼蛋白(Cap)抑制宿主細(xì)胞天然免疫應(yīng)答》、《不容小覷的新型豬圓環(huán)病毒:中國(guó)部分地區(qū)PCV3分子流行病學(xué)調(diào)查》等。

摘要：

對(duì)廣東省不同地區(qū)新生仔豬先天性震顫豬群中PCV3的流行病學(xué)情況進(jìn)行調(diào)查。采集的病料樣品，通過(guò)常規(guī)PCR進(jìn)行PCV3檢測(cè)與全基因擴(kuò)增，分析其全基因的遺傳進(jìn)化關(guān)系。將獲得的16株P(guān)CV3毒株核酸序列與其他環(huán)狀病毒參考毒株對(duì)全基因組和Cap基因進(jìn)行遺傳變異分析，結(jié)果顯示，新生仔豬的先天性震顫豬群中PCV3樣本總陽(yáng)性率高達(dá)58.2%。16株P(guān)CV3毒株之間全基因核苷酸序列同源性為99.5%～100%，與美洲代表毒株P(guān)CV3-US/MO2015全基因核苷酸序列同源性在98.8%～99.1%之間；16株P(guān)CV3毒株之間Cap基因的核苷酸序列同源性為99.7%～100%，與國(guó)內(nèi)外參考毒株的核苷酸同源性為99.1%～100%。遺傳進(jìn)化分析顯示，16株P(guān)CV3毒株都屬于PCV3a分支。PCV3在我國(guó)廣東省新生仔豬先天性震顫豬群中廣泛存在。

豬圓環(huán)病毒3型（Porcinecircovirus 3）是一種新發(fā)現(xiàn)的圓環(huán)病毒，2016年美國(guó)通過(guò)宏基因組技術(shù)從一些患有心肌炎的仔豬中檢測(cè)到一種新型的豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus,PCV），將其命名為PCV3，隨后在具有豬皮炎腎病綜合征、生殖繁殖障礙和心肌多系統(tǒng)炎癥的病豬中檢測(cè)到PCV3[1]。PCV3屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovirus），是無(wú)囊膜病毒，具有該圓環(huán)病毒科家族的環(huán)狀單鏈DNA基因組[2]。其基因組全長(zhǎng)約為2kb，主要包括3個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF),ORF1基因編碼的復(fù)制酶蛋白（replicase protein,Rep），主要參與病毒DNA的復(fù)制[3],ORF2基因編碼的核衣殼蛋白（capsid protein,Cap）是主要的結(jié)構(gòu)和抗原蛋白[4]，但是PCV3與PCV2的ORF2基因同源性只有37%[2],ORF3基因編碼的蛋白目前研究較少，其結(jié)構(gòu)與功能尚不清楚。自2016年以來(lái)，PCV3已在多個(gè)國(guó)家被檢測(cè)到，包括德國(guó)、意大利、中國(guó)[5,6,7]等。

先天性震顫多見(jiàn)于新生仔豬，其臨床特征是四肢、頭部或全身出現(xiàn)有節(jié)奏的震顫，雖然全身抖動(dòng)不直接導(dǎo)致仔豬死亡，但是可以導(dǎo)致仔豬行走、吃奶困難阻礙仔豬進(jìn)行哺乳，常因初乳攝入不足隨后可能導(dǎo)致嚴(yán)重的發(fā)育遲緩或饑餓死亡[8]。因此，仔豬先天性震顫對(duì)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在近一個(gè)世紀(jì)的過(guò)程中，仔豬先天性震顫在許多國(guó)家被報(bào)道，暗示其是一種世界性疾病[9,10,11,12,13,14]。雖然，它是在近一個(gè)世紀(jì)以前的文獻(xiàn)中被首次報(bào)道，大多數(shù)現(xiàn)代暴發(fā)的仔豬先天性震顫病因作用仍未定義。有文獻(xiàn)報(bào)道從仔豬先天性震顫中檢測(cè)出PCV3[15]，提示其與該病有密切聯(lián)系。因此，我們調(diào)查了廣東省不同地區(qū)新生仔豬先天性震顫豬群中PCV3流行情況。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑

PremixEx TaqTM酶和DNA DL2 000Maker、pMD19-T，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；病毒核酸提取試劑盒Magen RaPure Viral RNA/DNA Kit,Magen公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒，OMEGA公司產(chǎn)品。

1.1.2樣品來(lái)源

2017年2月～2018年4月收集122份樣品來(lái)源于廣東省的36個(gè)豬場(chǎng)。發(fā)病豬的臨床特征是四肢、頭部或全身出現(xiàn)有節(jié)奏的震顫，經(jīng)常無(wú)法吸吮母乳，導(dǎo)致其營(yíng)養(yǎng)不良或饑餓致死，采集發(fā)病豬的組織樣品，包括腦、脾臟、肺臟、淋巴結(jié)和血清。

1.2方法

1.2.1病料核酸的提取

稱(chēng)取各組織病料0.2g置于勻漿管中，加入不同規(guī)格的鋼珠和1mL生理鹽水后，置于組織勻漿機(jī)中勻漿30s,3個(gè)循環(huán)，勻漿后的樣品放置-80℃冰箱，反復(fù)凍融3次釋放病毒，8 000r/min低溫離心5min后獲取上清液。取250μL上清按照Magen RaPure Viral RNA/DNA Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行核酸的提取，置-80℃保存待用。

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成

參照Palinski R等[2]的研究合成1對(duì)引物用于PCV3檢測(cè)，并參考Fux R等[5]的研究合成3對(duì)引物用于PCV3全基因組擴(kuò)增（表1）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 PCV3特異基因擴(kuò)增引物

Table 1 Amplification primers forspecific genes of PCV3

1.2.3PCV3全基因組序列測(cè)定與分析

將PCV3陽(yáng)性樣品進(jìn)行全基因組序列測(cè)定，以陽(yáng)性樣品核酸為模板，用表1中的3對(duì)引物參考Premix Ex TaqTM酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行片段擴(kuò)增。PCV3全基因組擴(kuò)增體系為50μL:2×Premix Ex Taq 25μL，上、下游引物各取1μL，去離子水21μL，提取的DNA模板2μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min;94℃30s、55℃30s、72℃70s，共35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸3min。PCR產(chǎn)物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4基因克隆與測(cè)序分析

選擇瓊脂糖凝膠電泳為陽(yáng)性的樣品，用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，純化后克隆至pMD19-T載體，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行菌液PCR鑒定，將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送至深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5PCV3全基因序列拼接及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將測(cè)序獲得的3段序列進(jìn)行拼接，并與國(guó)內(nèi)外參考毒株序列進(jìn)行比對(duì)得到PCV3全基因組序列，應(yīng)用生物學(xué)軟件DNA Star V7.1、MEGA 7.0對(duì)PCV3全基因組及Cap基因序列與參考毒株序列比對(duì)進(jìn)行核苷酸同源性分析和繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2結(jié)果

2.1臨床樣品PCV3的檢測(cè)

應(yīng)用常規(guī)PCR對(duì)36個(gè)豬場(chǎng)送檢的122份臨床樣品進(jìn)DNA行檢測(cè)，結(jié)果顯示，122份樣品中的71份被鑒定為PCV3陽(yáng)性，樣品總陽(yáng)性率為58.2%(71/122),2017年和2018年（表2)PCV3臨床陽(yáng)性樣品數(shù)分別是34份和37份，PCV3的陽(yáng)性率分別為49.3%(34/69）和69.8%(37/53）。此外，在2017年21個(gè)豬場(chǎng)中有16個(gè)為PCV3陽(yáng)性場(chǎng)，豬場(chǎng)陽(yáng)性率為76.2%(16/21),2018年15個(gè)豬場(chǎng)中有12個(gè)為PCV3陽(yáng)性場(chǎng)，豬場(chǎng)陽(yáng)性率為80.0%(12/15），豬場(chǎng)總陽(yáng)性率為77.8%(28/36）。表明廣東省地區(qū)存在PCV3感染。

2.2PCV3的PCR檢測(cè)及全基因組PCR擴(kuò)增

經(jīng)常規(guī)PCR檢測(cè)出為陽(yáng)性的樣品進(jìn)行PCV3全基因組擴(kuò)增，3段引物PCV3-1-F/R、PCV3-2-F/R、PCV3-3-F/R經(jīng)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物大小與Fux R等[5]研究一致，分別為1 072、425、1 007bp（圖1）。將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，用于遺傳進(jìn)化分析。

表2病料樣品與豬場(chǎng)水平PCV3的陽(yáng)性率

Table 2 Detection rates of PCV3insamples and farms

2.3 PCV3全基因組的遺傳進(jìn)化分析

將本研究所獲得的16株P(guān)CV3毒株與國(guó)內(nèi)外的25株環(huán)狀病毒參考毒株序列應(yīng)用DNAStar的MegAline軟件進(jìn)行核苷酸同源性分析，并應(yīng)用MEGA 7.0構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)，分析PCV3全基因組與其他環(huán)狀病毒參考毒株之間的進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果表明，16株P(guān)CV3毒株之間核苷酸序列同源性為99.5%～100%，但與PCV1、PCV2的核苷酸同源性分別在43.6%～43.9%、44.0%～44.3%之間，與美洲代表毒株P(guān)CV3-US/MO2015之間的核苷酸序列同源性為98.8%～99.1%。全基因進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明，本研究的16株P(guān)CV3與最早發(fā)現(xiàn)的PCV3-US/2015在同一群中（圖2）。

2.4PCV3Cap基因的遺傳進(jìn)化分析

本研究獲得的16株P(guān)CV3毒株之間Cap基因的核苷酸序列同源性為99.7%～100%，與國(guó)內(nèi)外參考毒株的核苷酸同源性為99.1%～100%;16株P(guān)CV3Cap基因推導(dǎo)的氨基酸序列與參考毒株同源性為99.5%～100%?；蜻M(jìn)化樹(shù)分析表明，本研究的16個(gè)流行毒株均屬于PCV3a亞型（圖3）。

3討論

先天性震顫通常發(fā)生在新生仔豬中，其腦和脊髓表現(xiàn)出嚴(yán)重的病理?yè)p傷[8]。新生仔豬的先天性震顫在豬群中普遍存在，并對(duì)我國(guó)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[13]。自2016年在美國(guó)首次報(bào)道PCV3以來(lái)，在我國(guó)多個(gè)省也相繼出現(xiàn)PCV3感染的報(bào)道。大多數(shù)研究表明，PCV3感染與PDNS和生殖障礙有關(guān)[2]。而近年有報(bào)道稱(chēng)從仔豬先天性震顫的豬群中檢測(cè)到PCV3[13]。因此，我們對(duì)廣東省不同地區(qū)新生仔豬先天性震顫豬群進(jìn)行PCV3流行病學(xué)調(diào)查。

在本研究中，應(yīng)用常規(guī)PCR對(duì)臨床樣品進(jìn)行PCV3檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新生仔豬先天性震顫豬群中PCV3總陽(yáng)性率高達(dá)58.2%(71/122),2017年和2018年P(guān)CV3感染率分別為49.3%和69.8%，其感染率有上升的趨勢(shì)；豬場(chǎng)的陽(yáng)性率為77.8%。PCV3可以在不同的臨床組織樣品如腦、脾臟、肺臟、淋巴結(jié)及血清等中被檢測(cè)到，其中腦和淋巴結(jié)組織中檢出率最高，脾臟次之。大多數(shù)的研究[8,9,13,16]表明仔豬的先天性震顫是由豬非典型瘟病毒（AP-PV）引起的。先天性震顫的仔豬，其腦和脊髓表現(xiàn)出嚴(yán)重的病理?yè)p傷[8]，而本研究發(fā)現(xiàn)PCV3在腦中檢出率最高，且一些樣品APPV呈陰性。這些結(jié)果表明，PCV3可能也是引起新生仔豬先天性震顫的一種病原。

此外，通過(guò)PCR獲得了16株P(guān)CV3毒株?；蚪M全序列分析結(jié)果顯示，16株P(guān)CV3與其他的PCV3毒株相似，他們的全基因組大小均為2 000kb，具有兩個(gè)反向排列的開(kāi)放閱讀框（ORFs），主要編碼Cap和Rep蛋白，與之前報(bào)道的其他PCV3毒株進(jìn)行比較，全基因組沒(méi)有核苷酸的插入或缺失。序列分析顯示，16株P(guān)CV3全基因及ORF2基因的核苷酸同源性分別為99.5%～100%和99.7%～100%。Cap基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，本研究獲得的16株P(guān)CV3都分布在3a分支，說(shuō)明此次從廣東地區(qū)獲得的PCV3流行毒株屬于PCV3a亞型。

總之，研究結(jié)果表明PCV3在廣東省新生仔豬先天性震顫豬群中廣泛存在，且遺傳進(jìn)化分析顯示都屬于3a分支。這些結(jié)果對(duì)于更好地理解PCV3及其在新生仔豬先天性震顫豬群中的作用至關(guān)重要。

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