摘要：為了解小鼠不同品系、性別及體重對豬丹毒活疫苗安全評價的影響，按照《中華人民共和國獸藥典》豬丹毒活疫苗安全檢驗(yàn)方法，對小鼠品系（KM、ICR、C57BL/6N、BALB/c）、性別及體重3個因素進(jìn)行研究。結(jié)果顯示：上述4種品系小鼠按照2頭份接種均可通過豬丹毒活疫苗（GC42株）安全檢驗(yàn)，但接種劑量增加后，BALB/c小鼠死亡率最高，C57BL/6N小鼠耐受力最強(qiáng)；高劑量組雄性小鼠死亡率顯著高于雌性小鼠；小鼠隨著體重增加其耐受力也在增強(qiáng)。本研究首次發(fā)現(xiàn)C57BL/6N和BALB/c小鼠在獸用疫苗安全評價中耐受力存在較大差異，這提示在開展相關(guān)動物試驗(yàn)中應(yīng)重視上述因素對結(jié)果的影響。豬丹毒（swine erysipelas）是由紅斑丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）引起的傳染性疾病。近年來，豬丹毒由散發(fā)逐漸呈流行暴發(fā)態(tài)勢，對我國部分地區(qū)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。同時，作為人獸共患病，動物攜帶病原感染人的病例接連不斷，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全和動物源性食品安全。目前，在市場流通環(huán)節(jié)有豬丹毒活疫苗和滅活疫苗?；钜呙缫愿玫拿庖弑Ｗo(hù)效果受到廣大養(yǎng)殖場戶的青睞，為防控豬丹毒發(fā)揮了重要作用。根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》（2015年版三部）（以下稱《獸藥典》）規(guī)定，豬丹毒活疫苗安全檢驗(yàn)使用小鼠或豬進(jìn)行。從動物試驗(yàn)替代原則和經(jīng)濟(jì)成本考慮，優(yōu)先使用小動物替代大動物開展檢驗(yàn)。原豬丹毒活質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)自1985年提出至今，雖經(jīng)修訂，但是隨著活株疫苗生產(chǎn)代次的提高，使用小鼠進(jìn)行安全檢驗(yàn)的結(jié)果穩(wěn)定性可能會出現(xiàn)問題。同時，影響小鼠免疫反應(yīng)的幾種因素對豬丹毒活疫苗安全檢驗(yàn)的影響也不清楚。本研究選用豬丹毒活疫苗（GC42株），探索小鼠不同品系、性別及體重對安全檢驗(yàn)的影響，以期為豬丹毒活疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂以及企業(yè)生產(chǎn)檢驗(yàn)提供參考。鋪平板：將馬丁瓊脂融化待溫度降至50℃左右，按比例加入10%血清后，灌制平板，平板正置放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜，無雜菌生長為合格，待用。連續(xù)稀釋與滴平板：按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求每頭份樣品應(yīng)至少含有的活菌數(shù)以及樣品標(biāo)示的頭份數(shù)計(jì)算樣品稀釋倍數(shù)。本樣品為50頭份的豬丹毒活疫苗凍干苗，每批隨機(jī)抽樣3瓶，首先分別加入40mL馬丁肉湯充分溶解，各取1mL菌液與9mL馬丁肉湯進(jìn)行10倍系列稀釋，稀釋至10-6稀釋度，取10-6稀釋度菌液接種在制備好的含10%血清的馬丁瓊脂上，每瓶樣品接種平板3個，0.1mL/個，使菌液均勻散開，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中，待平板晾干后，倒置平板，培養(yǎng)48h。計(jì)算菌數(shù)：肉眼觀察平板菌落，并在平板底面點(diǎn)數(shù)，算出每個樣品的3個平板的平均菌落數(shù)，計(jì)算出每頭份疫苗中含有的活菌數(shù)（CFU）。檢驗(yàn)方法
《獸藥典》豬丹毒活疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，若選用小鼠進(jìn)行安全檢驗(yàn)，需要符合下述要求：按照疫苗標(biāo)簽注明頭份，將疫苗用20%氫氧化鋁膠生理鹽水稀釋，皮下注射體重20~22g小鼠10只，皮下注射10只，各2頭份，觀察14d。注射GC42疫苗的小鼠應(yīng)全部健活。否則，需用小鼠按照上述方法重檢1次，如果仍不符合規(guī)定，可用豬檢驗(yàn)1次。
小鼠不同品系對安全檢驗(yàn)的影響。本試驗(yàn)采用4種品系小鼠分別為KM、ICR、C57BL/6N和BALB/c，每組10只，分別按照上述檢驗(yàn)方法注射2、6和10頭份，重復(fù)3次試驗(yàn)。同時，小鼠體重均位于20~22g之間，全部為雌性。小鼠不同性別對安全檢驗(yàn)的影響。本試驗(yàn)采用雌性和雄性ICR小鼠（體重20~22g），每組10只，分別按照上述檢驗(yàn)方法注射2、6和10頭份，重復(fù)3次試驗(yàn)。小鼠不同體重對安全檢驗(yàn)的影響。本試驗(yàn)采用13~14、21~22和29~30g雌性ICR小鼠，每組10只，分別按照上述檢驗(yàn)方法注射2、6和10頭份，重復(fù)3次試驗(yàn)。使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANONA），P<0.05為差異顯著。豬丹毒活疫苗（GC42株）活菌計(jì)數(shù)由表1可知，活菌計(jì)數(shù)結(jié)果以每批產(chǎn)品3瓶樣品中含活菌數(shù)的最小值為最終結(jié)果，豬丹毒活疫苗（GC42株）的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果為11.2×108CFU/頭份，符合《獸藥典》中豬丹毒活疫苗活菌計(jì)數(shù)中含GC42活菌應(yīng)不低于7.0×108CFU/頭份的要求。
小鼠不同品系對豬丹毒活疫苗（GC42株）安全評價的影響由表2可知，按照《獸藥典》的要求，KM、ICR、C57BL/6N和BALB/c小鼠接種2頭份豬丹毒活疫苗（GC42株）安全評價一次性通過率均為100%。但是在6頭份和10頭份劑量免疫時，4種品系小鼠出現(xiàn)差異：KM小鼠在6頭份劑量組仍保持33.3%通過率；ICR小鼠在6頭份和10頭份組一次性通過率為0；C57BL/6N品系小鼠在3個劑量組未出現(xiàn)小鼠死亡，一次性通過率為100%；BALB/c小鼠在6頭份和10頭份組一次性通過率為0，且小鼠死亡率顯著高于其他各組（P<0.05）。
小鼠不同性別對豬丹毒活疫苗（GC42株）安全評價的影響由表3可知，在2頭份免疫組，雄性組小鼠出現(xiàn)1例小鼠死亡，雌性組小鼠3次試驗(yàn)全部合格；在6頭份和10頭份組，小鼠死亡數(shù)量均超過了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，同時可見，10頭份組雄性小鼠死亡率顯著高于雌性組（P<0.05）。
不同體重小鼠對豬丹毒活疫苗（GC42株）安全評價的影響由表4可知，21~22和29~30g小鼠免疫2頭份一次性通過率為100%。隨著小鼠體重增加，各免疫組小鼠死亡率呈下降趨勢。
疫苗安全性評價既有疫苗所含抗原本身對實(shí)驗(yàn)動物引起的特異性反應(yīng)，也包含疫苗內(nèi)的其他成分對機(jī)體引發(fā)的毒性反應(yīng)。在進(jìn)行安全性評價試驗(yàn)時，應(yīng)在動物死亡時判定是否屬于疫苗本身導(dǎo)致的死亡。小鼠是獸用生物制品安全評價最常用的實(shí)驗(yàn)動物之一，其穩(wěn)定性對疫苗安全檢驗(yàn)或評價至關(guān)重要，而實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)結(jié)果常出現(xiàn)結(jié)果不穩(wěn)定、可重復(fù)性差等問題。本研究聚焦小鼠品系、性別及體重等諸多因素，比較其對豬丹毒活疫苗（GC42）免疫反應(yīng)的差異。動物對各類細(xì)菌、病毒等微生物的易感性取決于其主要組織相容性復(fù)合體（MHC）。不同品系小鼠對同一微生物的免疫反應(yīng)可能存在明顯差異，如帶等位基因H-2b的小鼠（如C57BL/6N）比帶有等位基因H-2k的小鼠（如C58、C3H）抵抗力強(qiáng)。BALB/c小鼠極易受到假單胞菌強(qiáng)毒株的感染，而C57BL/6N小鼠則具有一定抵抗力。本研究表明，C57BL/6N小鼠對豬丹毒活疫苗（GC42株）的耐受力較其他3種品系小鼠最強(qiáng)，而同為近交系的BALB/c小鼠最為敏感，試驗(yàn)1數(shù)據(jù)顯示該組小鼠死亡率100%。按照《獸藥典》關(guān)于豬丹毒活疫苗安全檢驗(yàn)規(guī)定，接種2頭份劑量小鼠不能出現(xiàn)因疫苗導(dǎo)致的死亡。本研究證明，4種品系小鼠均可通過豬丹毒活疫苗（GC42株）安全檢驗(yàn)。性別也是遺傳因素的重要方面。通常認(rèn)為，雌鼠產(chǎn)生抗體水平通常高于雄鼠，并且維持時間也比雄性小鼠較長。同時，性激素作為內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)的重要一部分與免疫系統(tǒng)存在一定關(guān)聯(lián)。本研究比較了ICR小鼠雌性和雄性對不同劑量的豬丹毒活疫苗（GC42株）的耐受能力，結(jié)果顯示，在2頭份和6頭份劑量組雌性和雄性小鼠均未出現(xiàn)顯著差異，但是在10頭份劑量組，雄性小鼠死亡率顯著高于雌性小鼠。在獸用生物制品評價中選擇日齡適宜的實(shí)驗(yàn)動物是非常重要的。幼齡小鼠免疫系統(tǒng)機(jī)能發(fā)育不完善或機(jī)能很弱，但是成年后隨年齡增加免疫反應(yīng)的活性也減弱。本研究還探索了13~14g規(guī)格小鼠對豬丹毒活疫苗（GC42株）最為敏感，死亡率顯著高于其他各組，無法用于該疫苗的安全檢驗(yàn)。隨著體重增加，ICR小鼠對超劑量豬丹毒活疫苗的耐受力也逐漸增加。
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（責(zé)任編輯：許小楠）
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