七類消毒劑對非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測結果的影響

南文龍1，鞏明霞1，陸游1，2，李林1，王清華1，吳曉東1，陳義平1

摘要：為評價戊二醛、酚、含碘類等常用消毒劑消毒后對非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測結果的影響，基于畜禽欄舍、運載工具、器具消毒及皮膚黏膜消毒目的，按消毒劑說明書推薦選擇不同工作濃度，分別與不同滴度的非洲豬瘟病毒培養(yǎng)物于20℃條件下作用30min后，采用熒光定量PCR方法檢測作用后產(chǎn)物。結果顯示，與對應的陽性對照組相比，含氯類（二氯異氰尿酸鈉）、過硫酸氫鉀類、二氧化氯類消毒劑，消毒后對熒光定量PCR檢測結果影響最顯著，檢測Ct值顯著上升或檢測不到；戊二醛類、含碘類（主要成分聚維酮碘）消毒劑，核酸降解能力相對較弱，檢測Ct值稍有上升；酚類、季銨鹽類、含碘類（主要成分碘、磷酸、硫酸）類消毒劑，檢測Ct值基本無變化。本研究評價了7類常用消毒劑消毒對非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測結果的影響，可為防控實踐中科學、客觀評價分析消毒效果提供技術參考。

關鍵詞：非洲豬瘟；消毒劑；熒光定量PCR；消毒效果

中圖分類號：S852.61文獻標識碼：A文章編號：1005-944X（2021）03-0087-06DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2021.03.018

由于消毒劑滅活病毒機制不同，本研究擬采用熒光定量 PCR 方法檢測戊二醛、酚、含氯等 7 類 9 種常用消毒劑與 ASFV 培養(yǎng)物作用后的產(chǎn)物，評估對檢測結果的影響，以期為 ASF 防控實踐中科學、客觀評價分析消毒效果提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 消毒劑

收集市面常見的戊二醛、酚、含碘、季銨鹽、含氯、過硫酸氫鉀、二氧化氯等 7 類消毒劑，包括戊二醛類2 種、酚類1 種，含碘類2 種、季銨鹽1 種、含氯類 1 種、過硫酸氫鉀類 1 種、二氧化氯類 1 種。消毒劑產(chǎn)品詳細信息見表 1，所有產(chǎn)品均注冊有獸藥產(chǎn)品批準文號，試驗時均在有效期內。

1.2 病毒

ASFV 中國分離株：CN2018/1，由國家非洲豬瘟參考實驗室分離鑒定并保存。

1.3試劑與耗材

DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清，購自 GIBCO 公司；細胞瓶及 96 孔細胞板，購自 Corning 公司；病毒RNA/DNA 提取試劑盒，購自天根公司；熒光定量PCR 擴增試劑 Luna 通用探針法 qPCR 預混液，購自 NEB 公司。

1.4 豬肺泡巨噬細胞、紅細胞和血清制備

無菌采集健康豬肺臟，向肺臟注入滅菌 PBS 灌洗數(shù)次，收集灌洗液；離心收集豬肺泡巨噬細胞， 按 5×106 個 /mL、100 μL/ 孔接種 96 孔板；鋪板次日進行測試。

同步無菌采集抗凝血，離心收集血清；之后將細胞沉淀洗滌 3~5 次，棄去白細胞和血小板，用PBS 配成 10% 豬紅細胞懸液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?

1.5 病毒滴度測定

采用含 1% 豬血清的 PBS 10 倍連續(xù)稀釋ASFV 培養(yǎng)物至 10-8，以每孔 100 μL 接種 96 孔板上的豬肺泡巨噬細胞培養(yǎng)物，同時加入 1% 豬紅細胞 10 μL，每個稀釋度做 4 個重復孔。將 96 孔板置于 37 ℃ 5% CO2 條件下培養(yǎng) 6 d，每天觀察，記錄并統(tǒng)計各稀釋度培養(yǎng)孔中紅細胞吸附（HAD） 反應結果，采用 Reed-Muench 法計算半數(shù)紅細胞吸附量（HAD50）。

1.6 消毒劑與 ASFV 作用

采用 PBS 10 倍連續(xù)稀釋經(jīng)病毒滴度測定后的ASFV 培養(yǎng)物，取 101~104 倍稀釋液備用。參考農(nóng)業(yè)農(nóng)村部文件《關于在非洲豬瘟防控中做好消毒劑選擇工作的通知》， 以有效滅活 ASFV 為目的，基于畜禽欄舍、運載工具、器具消毒及皮膚黏膜（部分含碘類消毒劑適用） 等不同消毒場景，按消毒劑說明書標明濃度范圍合理選擇工作濃度，并將消毒劑原液制成 10 倍工作濃度備用。將 0.1 mL 消毒劑 10 倍工作濃度液和0.1 mL 不同稀釋度病毒液分別加入到 0.8 mL PBS 中充分混合，20 ℃條件下作用 30 min，作用后產(chǎn)物直接用于后續(xù)測試。無法制成 10 倍工作濃度液的含碘類消毒劑 C1，按照 1:2 工作濃度，將 0.5 mL 消毒劑原液和 0.1 mL 不同稀釋度病毒液，分別加入到 0.4 mL PBS 中充分混合，按相同條件作用處理，作用后產(chǎn)物直接用于后續(xù)測試。陽性對照組， 直接將 0.1 mL 不同稀釋度病毒液加入 0.9 mL PBS 中充分混合；陰性對照組，直接取 1 mL PBS。陰、陽性對照均按相同條件作用處理，作用后產(chǎn)物直接用于后續(xù)測試。

1..7 病毒 DNA 提取

取 200 μL 上述作用后產(chǎn)物，按病毒 RNA/ DNA 提取試劑盒說明，于 Thermo 自動核酸提取儀上提取病毒核酸，將提取的核酸保存于 -80 ℃冰箱備用。

1..8 熒光定量 PCR 擴增

采用 OIE《陸生動物診斷實驗和疫苗手冊》（2012 版）第 2.8.2 章節(jié)中，King 等 [1] 基于 VP72蛋白建立的 ASFV 熒光定量 PCR 方法檢測。上、下游引物和探針由上海生工生物技術有限公司合成。PCR 反應體系為：2×qPCR 預混液 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.8 μL，探針（10 μmol/L）0.4 μL，模板 DNA 2 μL，最后用滅菌水補齊至20 μL。反應條件為：50 ℃孵育 2 min；95 ℃預變性 3 min；95 ℃預變性 15 s，58 ℃退火延伸 1 min（采集 FAM 熒光信號），共 40 個循環(huán)。

1.9 檢測結果分析

按 1.6—1.8 步驟，重復處理各組樣品 3 次并檢測，統(tǒng)計平均 Ct 值，計算批間變異系數(shù)；取同一批次提取核酸重復檢測 3 次，統(tǒng)計平均 Ct 值， 計算批內變異系數(shù)。統(tǒng)計各組檢測平均 Ct 值，將各組檢測結果分別與對應陽性對照組比較，采用SPSS 21.0 軟件進行單因素方差分析，以 P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 病毒滴度測定

經(jīng) 測 定，ASFV 培 養(yǎng) 物 病 毒 滴 度 為 107.2 HAD50/mL。采用 PBS 10 倍連續(xù)稀釋后，本試驗中與消毒劑作用的 ASFV 滴度為 102.2~105.2 HAD50/mL。

2.2 各消毒劑檢測結果

消毒劑在選定稀釋度下與不同滴度 ASFV 作用后，采用熒光定量 PCR 檢測，結果詳見表 2。重復處理樣品檢測 3 次，各組平均 Ct 值批間變異系數(shù)為 0.3%~6.7%；取同一批次樣品提取病毒核酸重復檢測 3 次，各組平均 Ct 值批內變異系數(shù)為0.1%~2.3%。

結果（表 2）顯示，本研究中不同滴度 ASFV 與戊二醛類消毒劑作用后，熒光定量 PCR 檢測 Ct 值均顯著上升。與陽性對照組相比，戊二醛類 A1 產(chǎn)品 1:80~1:200 稀釋下，當病毒滴度為 105.2~103.2 HAD50/mL 時，檢測 Ct 值上升約 3.19~4.15；當病毒滴度為 102.2 HAD /mL 時，未檢測到 Ct 值。A2 產(chǎn)品在 1:80~1:200 稀釋滅活不同滴度病毒后，檢測 Ct 值上升 1.21~4.33。

酚類B 產(chǎn)品與不同滴度病毒作用后檢測發(fā)現(xiàn)， 與對應陽性對照組測定 Ct 值基本相當，僅個別檢測結果出現(xiàn) Ct 值波動（如 1:200 工作濃度下滅活102.2 HAD /mL 病毒時），總體看酚類 B 產(chǎn)品滅活病毒后對熒光定量 PCR 檢測結果影響不大。

含碘類C1 產(chǎn)品，當滅活病毒滴度為 105.2~104.2 HAD50/mL 時，檢測 Ct 值變化不顯著；當滅活病毒滴度為 103.2~102.2 HAD /mL 時，檢測 Ct 值顯著上升 3.45~5.76。C2 產(chǎn)品與不同滴度病毒作用后檢測發(fā)現(xiàn)，當滅活病毒滴度為103.2~105.2 HAD /mL 時， 比對應陽性對照組測定Ct 值稍有上升（0.46~1.06）；僅滅活病毒滴度為 102.2 HAD /mL 時，2.00% 稀釋度下檢測結果 Ct 值明顯上升（約 2.46）。

季銨鹽類 D 產(chǎn)品與不同滴度病毒作用后檢測發(fā)現(xiàn)，與對應陽性對照組測定 Ct 值基本相當，基本無顯著差異。

含氯類 E 產(chǎn)品與不同滴度病毒作用后檢測， 均未檢測到 Ct 值。

過硫酸氫鉀類 F 產(chǎn)品，當滅活病毒滴度為105.2 HAD /mL 時，檢測 Ct 值上升約 1.68；當滅活病毒濃度為 104.2~102.2 HAD /mL 時，均未檢測到 Ct 值。

二氧化氯類 G 產(chǎn) 品，當滅活病毒滴度為 105.2~104.2 HAD /mL 時 ， 檢 測 Ct 值 上 升5.17~7.52；當滅活病毒滴度為 103.2~102.2 HAD /mL時，均未檢測到 Ct 值。

3 討論

ASFV 屬于囊膜 DNA 病毒，對環(huán)境抵抗力強， 但對戊二醛、含氯、含碘類等多數(shù)常用種類消毒劑敏感 [2]。現(xiàn)場消毒后，常需對消毒效果進行監(jiān)測評價，以防止由于消毒不徹底造成 ASFV 傳播擴散。目前，采用病毒分離方法只能在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部指定實驗室中開展，且技術難度大、檢測周期長，而檢測抗原的 ELISA 或膠體金等免疫學檢測方法敏感性達不到消毒效果評價要求。分子生物學方法特別是熒光定量 PCR 方法，具有簡便、快速、高通量等優(yōu)勢，是實踐中 ASFV 病原檢測最主要手段，且適用于唾液、血液、組織、環(huán)境拭子等多種樣品類型，可廣泛應用于養(yǎng)殖場、屠宰場、無害化處理廠、運輸車輛等多種場景消毒效果評估。

結果顯示，與其他幾種消毒劑相比，含氯類（二氯異氰尿酸鈉）、過硫酸氫鉀類、二氧化氯類 3 類消毒劑，消毒后對熒光定量 PCR 檢測結果影響最顯著，檢測 Ct 值明顯上升或未檢測到，且其影響能力排序為：含氯類（二氯異氰尿酸鈉）＞ 過硫酸氫鉀類＞二氧化氯類。含氯類消毒劑（二氯異氰脲酸鈉）遇水后可釋放出次氯酸，可導致病原蛋白質變性、改變膜通透性并可直接影響 DNA 合成等來殺滅病原 [3]。本研究中含氧類消毒劑與滴度≤ 105.2 HAD /mL 病毒作用后檢測，均未見 Ct 值。當前市售過硫酸氫鉀類消毒劑，多由過硫酸氫鉀、表面活性劑、無機鹽與有機酸等組成，其消毒原理：一是利用過硫酸氫根的強氧化能力，在水溶液中產(chǎn)生羥基自由基等改變微生物細胞膜的通透性使之破裂；二是使用時過氧離子能將氯離子氧化為次氯酸，達到殺滅病原目的 [4]。本研究中過硫酸氫鉀類消毒劑與滴度為 105.2 HAD /mL 病毒作用后檢測時 Ct 值上升，與≤ 104.2 HAD /mL 病毒作用后檢測未見 Ct 值。二氧化氯類消毒劑是一類強氧化劑，并兼具含氯類消毒劑作用機制，可與細胞內部酶發(fā)生氧化反應，還可氧化分解氨基酸、核酸等，使微生物蛋白質的合成被抑制并導致蛋白質功能喪失 [5]。本研究中當二氧化氯類消毒劑與滴度104.2~105.2 HAD /mL 病毒作用后檢測 Ct 值上升， 與≤ 103.2 HAD /mL 病毒作用后檢測均未見Ct 值， 可推斷其核酸降解能力弱于前兩者。

戊二醛類消毒劑，主要通過凝固病原微生物蛋白質中的氨基、羧基，破壞病原微生物蛋白分子使其死亡 [6]，在本研究中戊二醛類消毒劑顯示較弱的核酸降解能力。A1 產(chǎn)品僅當與滴度≤ 102.2 HAD50/mL 病毒作用后檢測未見Ct 值。A1、A2 相比， 當滅活病毒滴度為 102.2 HAD /mL 時，A2 仍可檢測到 Ct 值而 A1 未檢測到，表明 A1 對檢測 Ct 值影響大于 A2，推測可能與 A1 具有更高戊二醛工作濃度有關。

含碘類消毒劑消毒時，游離狀態(tài)的碘原子產(chǎn)生強氧化作用，主要破壞病原體的細胞膜結構及蛋白質分子，并可部分作用于核酸 。本研究中顯示含碘類消毒劑具有較弱的核酸降解能力，C1 僅當與滴度為 103.2~102.2 HAD /mL 病毒作用后，檢測Ct 值出現(xiàn)上升。

本研究中的酚類和季銨鹽類消毒劑，消毒后與對應陽性對照組測定 Ct 值基本相當。酚類屬于原生質毒物，可穿透破壞細胞膜、沉淀蛋白質 [2]；季銨化合物是一種膜活性劑，可損傷、破壞細胞膜， 導致細胞質電位和 pH 梯度變化 [2]，兩者在消毒原理上對核酸作用小。

采用熒光定量 PCR 檢測評估對 ASFV 的消毒效果時，未檢測到 Ct 值的原因：一方面是消毒劑本身即具有核酸降解能力，另一方面是消毒前后進行的清潔、清洗也會清除 ASFV 核酸。由于熒光PCR 方法原理是對病毒核酸檢測，現(xiàn)場檢測時若結果陽性，僅表示存在 ASFV 核酸，并不能說明病毒本身是否存活，是否達到有效滅活效果還應根據(jù)現(xiàn)場條件以及使用消毒劑種類、使用濃度、作用時間等因素綜合分析。此外，也可考慮采用指示微生物方式進行輔助的消毒效果驗證。綜上所述，本研究評估了 7 類 常用消毒劑滅活 ASFV 后，對熒光定量 PCR 檢測結果的影響，可為 ASFV 消毒效果評價提供技術參考。

參考文獻（略）