豬場(chǎng)要確定感染的是非瘟野毒還是弱毒，需要使用設(shè)計(jì)引物（MGF505缺失或CD2V缺失）進(jìn)行鑒別診斷。目前國內(nèi)先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開發(fā)出三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，一次檢測(cè)可以鑒別是什么類型的毒株，效率更高。

近期深圳海關(guān)公布了一種用于非洲豬瘟病毒MGF_360-14L和CD2v雙基因缺失鑒別診斷的三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，具體內(nèi)容如下。

三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR簡介

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起的家豬和野豬的一種傳染病。在本研究中，作者建立了一種三重實(shí)時(shí)定量PCR方法來檢測(cè)和區(qū)分基因雙缺失的ASFV株和野生型ASFV株。

本方法中，設(shè)計(jì)了3對(duì)引物和探針，分別針對(duì)B646L基因（p72）、MGF_360-14L基因（位于MGF360-505R基因中間）和CD2v基因的保守區(qū)。該方法特異性良好，可將基因缺失（MGF360-505R和/或CD2v基因缺失）和野生型ASFV株與PCV2、CSFV、PRRSV、FMDV、SVA或其他病原的核酸相互區(qū)分開。含B646L基因、MGF_-14L基因和CD2v基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA的檢測(cè)限分別為7.9拷貝、9.7拷貝和9.6拷貝。

采用OIE推薦的三重rPCR和本文建立的實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)1215份樣品進(jìn)行了平行檢測(cè)，兩種方法的B646L基因檢測(cè)結(jié)果完全一致。成功地建立了三重定量PCR檢測(cè)方法，用于鑒定感染ASFV野毒株或感染ASFV雙基因缺失毒株的豬只。

該方法的特點(diǎn)

2.1 基因缺失的ASFV減毒疫苗已成為最有前途的ASF候選商品疫苗；

2.2 區(qū)分野生型ASFV和疫苗毒株的試驗(yàn)方法對(duì)ASF的預(yù)防和控制至關(guān)重要；

2.3 本文采用三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)ASFV基因組中B646L基因、MGF_360-14L基因和CD2v基因；

2.4 三重?zé)晒舛縋CR法具有良好的特異性和敏感性。

該方法的實(shí)施

3.1引物

3.2 反應(yīng)體系

最終的熒光定量PCR混合物含有THUNDERBIRD探針qPCR混合物（包括dNTPs、Mg2+、rTaq DNA聚合酶）、正向和反向引物各0.5μL（每個(gè)引物的最終濃度為200 nM）、TaqMan探針各0.3μL（最終濃度為120 nM）、DNA模板5μL，并用無核酸酶水配制至25μL。

3.3 反應(yīng)條件

在合適的熒光定量儀器上可以進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：95°C 40 s，然后40個(gè)循環(huán)：95°C 8 s，58°C 45 s。在58°C下檢測(cè)熒光信號(hào)。