發(fā)酵豆粕中的小肽與抗原蛋白是衡量品質(zhì)優(yōu)劣的兩項(xiàng)重要指標(biāo)，長期以來國內(nèi)的發(fā)酵豆粕產(chǎn)品主要由乳酸菌通過厭氧發(fā)酵生產(chǎn)，而出于便捷考慮，業(yè)內(nèi)通常使用酸溶蛋白法測(cè)定小肽含量，使用ELISA法測(cè)定抗原蛋白含量，但隨著發(fā)酵技術(shù)的提升，由芽孢桿菌通過有氧發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵豆粕在國內(nèi)市場(chǎng)上漸露鋒芒，這兩種測(cè)定方法是否適用，是否能作為客觀反映小肽和抗原蛋白真實(shí)含量的指標(biāo)，引起了關(guān)注與討論。

1 小肽-酸溶蛋白法

①不同pH 發(fā)酵（或酶解）的豆粕在酸中的溶解度不同

微生物發(fā)酵過程中對(duì)蛋白質(zhì)的分解，實(shí)質(zhì)上就是微生物產(chǎn)蛋白酶的作用。但是，不同酸堿性的蛋白酶酶解豆粕所得的小肽在酸中的溶解度不同，其中酸性蛋白酶酶解小肽高達(dá)96%可以溶于三氯乙酸，而堿性蛋白酶酶解小肽不到 50%。因此，酸溶蛋白更適合評(píng)估酸性發(fā)酵或酶解的豆粕產(chǎn)品，將低估希杰速益肽這類芽孢桿菌發(fā)酵的中偏堿性產(chǎn)品的小肽含量（劉慧珍，江南大學(xué)碩士論文，2007）。速益肽 55%CP 產(chǎn)品酸溶蛋白相對(duì)低（6-10%）。

②小肽應(yīng)有明確的分子量定義

食品國家標(biāo)準(zhǔn)《大豆肽粉GBT 22492》2008 版將小肽的定義由＜10 KDa 降低到＜5 KDa。營養(yǎng)學(xué)上關(guān)于小肽的定義稍有差別，但是以分子量范圍來定義是共識(shí)。高效凝膠過濾色譜法（HPLC）是小肽含量和蛋白分解程度測(cè)定的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。該方法以多孔性填料為固定相，依據(jù)樣品組分分子體積大小的差別進(jìn)行分離，在肽鍵的紫外吸收波長214nm 條件下檢測(cè)，使用凝膠色譜測(cè)定分子量分布。研究也表明，發(fā)酵豆粕中大分子蛋白的分解程度（蛋白質(zhì)和肽的分布）與仔豬小腸絨毛結(jié)果和生長性能相關(guān)（張露露等，2016）。傳統(tǒng)的酸溶蛋白不能區(qū)分蛋白氮、游離氨基酸氮和非蛋白氮，也不能給出明確的分子量。

③酸溶蛋白只體現(xiàn)了速益肽小肽含量的一小部分

希杰研究所實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，同時(shí)測(cè)定的發(fā)酵豆粕樣品整體蛋白分布（紅色峰）和三氯乙酸溶解后上清液的蛋白分布結(jié)果（藍(lán)色峰）。三氯乙酸提取的分子量5kDa 以下蛋白質(zhì)部分，而紅色圖譜和藍(lán)色圖譜之間存在一個(gè)灰色的面積區(qū)域是三氯乙酸沒有辦法提取出來的樣品中的肽含量的部分，即三氯乙酸并不能完全溶解出樣品中的所有的肽，只能溶解出其中的一小部分（如下圖）。

2 抗原蛋白-ELISA 法和SDS 法

①ELISA 法測(cè)定加工豆類產(chǎn)品的缺陷

致敏性不確定：目前已有商品化大豆抗原蛋白的檢測(cè)試劑有大豆球蛋白檢測(cè)試劑盒和β-伴大豆球蛋白檢測(cè)試劑盒，但是另兩種大豆抗原蛋白 Gly m Bd 30K 和 Gly m Bd 28K 并沒有商品化試劑盒。這兩種抗原蛋白分別被 65%和 25%的大豆過敏病人血清識(shí)別。目前商品化的β-伴大豆球蛋白的α亞基與α’亞基、β亞基之間有很高的同源性，分別為 90.14 和 76.2%，但是α’亞基、β亞基并不是致敏蛋白。

變異大：目前主流的商品化試劑盒法不適用于熱加工后大豆產(chǎn)品。首先熱加工過程中，蛋白變性和美拉德反應(yīng)都將影響產(chǎn)品中的抗原萃取率，而當(dāng)前主流商品化試劑盒中使用的Tris-Hcl 萃取液實(shí)際的抗原萃取率不到50%，且變異大（如下圖）。

假陽性：目前主流的商品化試劑盒法在測(cè)定發(fā)酵或酶解后的大豆產(chǎn)品也存在爭(zhēng)議。大豆抗原蛋白亞基（導(dǎo)致抗原活性的基礎(chǔ)）在分解過程中，一方面通過降解減少抗原活性，另一方面也將導(dǎo)致更多的抗原表位暴露，從而增加“所謂”的抗原活性，但是這種活性是否能引起過敏反應(yīng)仍不清楚。一般認(rèn)為抗原分子量一般在10 KDa 以上，具有良好抗原活性其分子量需超過500 KDa。傳統(tǒng)的營養(yǎng)學(xué)理論也認(rèn)為只有完整的抗原亞基進(jìn)入血液才能導(dǎo)致致敏反應(yīng)。因此希杰認(rèn)為SDS 是鑒定抗原降解的有效方法，并以最小亞基分子量30 KDa 作為豆粕降解標(biāo)準(zhǔn)，如下圖。

②ELISA測(cè)定食品抗原問題探討

影響因素：提取方法；水解或發(fā)酵；熱加工；交叉反應(yīng)

結(jié)論：

FDA（2005）認(rèn)為多數(shù)ELISA方法可能并不適用；

ELISA檢測(cè)不出也不能判斷無抗原活性，建議用Western判定。

③SDS 電泳測(cè)定抗原的注意事項(xiàng)

抗原萃取率：不同溶劑對(duì)大豆抗原的萃取結(jié)果差異很大，高溫使發(fā)酵豆柏表層蛋白變性，并發(fā)生美拉德反應(yīng)，Tris-HCl 提取液不能將被變性蛋白包裹的抗原蛋白提取出來。而堿性溶液萃取率較好，其中氫氧化鉀對(duì)大豆蛋白的萃取率約70%，尿素的萃取率最佳（80~90%）。

上樣蛋白濃度：發(fā)酵豆粕產(chǎn)品因加工工藝差異較大，即使用萃取率最高的試劑進(jìn)行萃取，萃取率也是有較大差異的，因此SDS 電泳測(cè)定各產(chǎn)品的抗原前，需要確定上樣樣品的蛋白含量是否一致，以校正萃取率的差異，否則將出現(xiàn)萃取率高的產(chǎn)品條帶多。希杰速益肽分解程度高，采用低溫干燥，熱損傷低，萃取率高；而部分高溫處理產(chǎn)品萃取率較低，從而導(dǎo)致測(cè)定假象（見下圖，某國際知名農(nóng)牧企業(yè)提供）。

希杰推薦的蛋白濃度測(cè)定方法如下：將離心后樣品稀釋20X，取50μL 與950μL BCA 反應(yīng)液混勻（20X 倍數(shù)關(guān)系），放置在37℃恒溫箱30min。反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定562nm 的吸光度。用已知不同濃度的BSA（牛血清蛋白0、0.25、0.5、1、1.25mg/mL）與BCA 混合（20X 倍數(shù)關(guān)系，同上）后于37℃恒溫箱30min 反應(yīng)后的吸光度求校正曲線及其方程。計(jì)算得出樣品中40ug 蛋白含量的點(diǎn)樣量。