益生菌作為綠色飼料添加劑在家禽生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)作為益生菌主要菌種，是動(dòng)物腸道的常駐菌，與其他細(xì)菌相比具有獨(dú)特的生理特性及益生功能，產(chǎn)生的酶能將飼糧中的粗蛋白質(zhì)降解為小肽、游離氨基酸等小分子物質(zhì)，增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高生長(zhǎng)性能，促進(jìn)免疫器官和免疫系統(tǒng)發(fā)育，提高抗病力。乳酸菌可產(chǎn)生細(xì)菌素、乳酸、抑制蛋白等，抑制有害菌的生長(zhǎng)；維持消化道微生態(tài)平衡，保持畜禽腸道健康，提高養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。飼糧中添加乳酸菌可促進(jìn)雛雞腸絨毛發(fā)育，改變腸黏膜結(jié)構(gòu)，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和利用；促進(jìn)短鏈脂肪酸的形成，降低動(dòng)物腸道pH，從而提高蛋白質(zhì)溶解度，促進(jìn)蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)分解。鄧慶慶等研究還發(fā)現(xiàn)，肉雞飼喂乳酸菌制劑可以改善由黃曲霉毒素導(dǎo)致的生長(zhǎng)性能下降，提高肉雞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀代謝率，從而提高肉雞生長(zhǎng)性能。

乳酸菌菌種不耐高溫，其固態(tài)制劑的干燥工藝多為真空冷凍干燥，成本過(guò)高，限制了其在動(dòng)物養(yǎng)殖上使用。將乳酸菌菌液直接飼喂動(dòng)物，則避免了干燥的環(huán)節(jié)，降低了使用成本。目前，乳酸菌菌液飼喂動(dòng)物有多種方式，不同飼喂方式的效果缺乏比較?；诖?，本試驗(yàn)通過(guò)飲水、灌服和拌料3種飼喂方式飼喂肉雞乳酸菌菌液，研究其對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能、粗蛋白質(zhì)表觀代謝率及腸道健康的影響，以期為乳酸菌菌液在肉雞生產(chǎn)中科學(xué)應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物：192只1日齡愛(ài)拔益加(AA)肉雞。

試驗(yàn)菌種：植物乳桿菌(L.plantarum)，本實(shí)驗(yàn)室前期篩選、鑒定并保存，試驗(yàn)前活化培養(yǎng)，活菌數(shù)為4×109CFU/mL。

基礎(chǔ)飼糧：購(gòu)自洛陽(yáng)某飼料廠，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供： VA 15 000 IU，VB12 10 μg，VD? 2 000 IU，VE 10 IU，VK? 0.5 mg，膽堿1 300 mg，核黃素 3.6 mg，泛酸10 mg，煙酸35 mg，硫胺素1.8 mg，吡哆醇3.5 mg，生物素0.15mg，葉酸 0.55 mg，F(xiàn)e 80 mg，Zn 40 mg， Mn60 mg，Cu8 mg，Se 0.15 mg。

2)代謝能為計(jì)算值，其他營(yíng)養(yǎng)水平為實(shí)測(cè)值。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理

將192只1日齡肉雞隨機(jī)分為4個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8只雞。對(duì)照組(CON組)飼喂基礎(chǔ)飼糧；拌料組(MIX組)在基礎(chǔ)飼糧中添加乳酸菌菌液；灌服組(OI組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，并口腔灌服乳酸菌菌液；飲水組(DW組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，并在飲水中添加乳酸菌菌液。飼養(yǎng)試驗(yàn)在河南科技大學(xué)牧場(chǎng)進(jìn)行，采用2階段籠養(yǎng)。試驗(yàn)期42d。肉雞自由采食、飲水，正常控溫光照，全程無(wú)免疫。

為保證各組肉雞每日采食乳酸菌活菌數(shù)基本相等(約8×108 CFU)。根據(jù)肉雞在飼養(yǎng)過(guò)程中水料比3：1原則、國(guó)家飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)及類(lèi)似試驗(yàn)參考值，確定AA肉雞平均日采食量(1～21日齡平均采食量48 g，22～42日齡平均采食量156g)，通過(guò)計(jì)算確定不同飼喂方式下1～21日齡和22～42日齡的乳酸菌菌液添加量，如表2所示。MIX組每周及時(shí)進(jìn)行拌料，OI組每日進(jìn)行1次口腔灌服，DW組根據(jù)肉雞飲水情況及時(shí)向水箱中補(bǔ)充混有乳酸菌菌液的飲用水。

注：乳酸菌實(shí)際攝入量是根據(jù)本試驗(yàn)肉雞平均日采食量及飲水量得到的肉雞實(shí)際每日攝入乳酸菌量。

1.3指標(biāo)及測(cè)定方法

1.3.1生長(zhǎng)性能測(cè)定

每周記錄每個(gè)重復(fù)投料量、剩料量和飲水量，在21、42日齡禁食12h后，對(duì)每個(gè)重復(fù)的肉雞稱(chēng)重，計(jì)算平均日飲水量、平均日采食量、平均日增重和料重比。

1.3.2粗蛋白質(zhì)表觀代謝率測(cè)定

在21、42日齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)取1只雞，按照Steenfeldt 等的試驗(yàn)方法進(jìn)行代謝試驗(yàn)，收集3d的糞樣及飼糧樣品，依據(jù)《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》利用半自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量，粗蛋白質(zhì)表觀代謝率計(jì)算公式如下：

粗蛋白質(zhì)表觀代謝率(%)=100×(飼糧中粗蛋白質(zhì)含量-糞中粗蛋白質(zhì)含量)/飼糧中粗蛋白質(zhì)含量。

1.3.3腸道組織形態(tài)測(cè)定

在21、42日齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)抓取1只肉雞進(jìn)行屠宰，分離出空腸、回腸，各取2cm腸段，生理鹽水沖洗后放入4%多聚甲醛中固定保存，進(jìn)行石蠟切片制作，蘇木精-伊紅(HE)染色后在光學(xué)顯微鏡下對(duì)組織形態(tài)進(jìn)行觀察。利用CaseViewer 2.4圖像處理系統(tǒng)對(duì)腸道絨毛高度、絨毛寬度、隱窩深度進(jìn)行測(cè)量，利用絨毛高度和絨毛寬度計(jì)算絨毛表面積，并計(jì)算絨毛高度與隱窩深度的比值(絨隱比，CD/VH)。

1.3.4盲腸內(nèi)容物菌群的Illumina高通量測(cè)序及盲腸活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)

在21、42日齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取1只肉雞屠宰，無(wú)菌采取左側(cè)盲腸內(nèi)容物，液氮保存，送上海元華生物科技有限公司，利用Illumina測(cè)序系統(tǒng)對(duì)盲腸內(nèi)容物菌群基因組DNA的16S rRNA V3～V4區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析。

同時(shí)，取0.5g腸道內(nèi)容物于lmL無(wú)菌生理鹽水中，37℃搖床中培養(yǎng)30min，稀釋到10-7～10-2，用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算大腸桿菌、志賀氏菌、乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量。大腸桿菌采用EMB培養(yǎng)基，志賀氏菌采用SS培養(yǎng)基，好氧培養(yǎng)24h；乳酸菌采用LBS培養(yǎng)基，雙歧桿菌采用TPY培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng) 48 h。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 20.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用一般線性模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(oneway ANOVA)和Duncan氏法多重比較，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2結(jié)果

2.1乳酸菌不同飼喂方式對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，在1～21日齡，DW組平均日采食量和平均日飲水量顯著低于CON組(P<0.05)，MIX組、OI組和DW組料重比顯著低于CON組(P<0.05)。mix組、oi組和dw組之間平均日采食量、平均日飲水量、平均日增重?zé)o顯著差異(p>0.05)，MIX組、DW組料重比顯著低于OI組(P<0.05)。

在22～42 日齡，MIX組、OI組和DW組平均日增重顯著高于CON組(P<0.05)，料重比顯著低于CON組(P<0.05)。mix組、oi組和dw組之間平均日采食量、平均日飲水量、平均日增重和料重比無(wú)顯著差異(p>0.05)。

在1～42日齡，DW組和MIX組平均日增重顯著高于CON組(P<0.05)，MIX組、OI組和DW組料重比顯著低于CON組(P<0.05)。mix組、oi組和dw組之間平均日采食量、平均日飲水量、平均日增重和料重比無(wú)顯著差異(p>0.05)。

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無(wú)字母表示差異不顯著(p>0.05)。表4、表5和表7同。

2.2乳酸菌不同飼喂方式對(duì)肉雞粗蛋白質(zhì)表觀代謝率的影響

由表4可知，21和42日齡時(shí)，MIX組、OI組和DW組粗蛋白質(zhì)表觀代謝率均顯著高于CON組(P<0.05)。21日齡時(shí)，mix組、oi組和dw組之間粗蛋白質(zhì)表觀代謝率差異不顯著(p>0.05)；42 日齡時(shí)，DW組粗蛋白質(zhì)表觀代謝率顯著高于OI組(P<0.05)，與mix組差異不顯著(p>0.05)。

2.3乳酸菌不同飼喂方式對(duì)肉雞腸道形態(tài)的影響

由表5可知，21日齡時(shí)，在空腸中，MIX組、OI組和DW組絨毛高度、絨毛表面積和絨隱比均顯著高于CON組(P<0.05)，隱窩深度顯著低于CON組(P<0.05)。mix組、oi組和dw組絨毛高度、絨毛表面積差異不顯著(p>0.05)；DW組隱窩深度顯著低于MIX組(P<0.05)，與oi組差異不顯著(p>0.05)；DW組絨隱比顯著高于OI組(P<0.05)，與mix組差異不顯著(p>0.05)。在回腸中，MIX組絨毛高度、絨毛表面積、絨隱比顯著高于CON組(P<0.05)，隱窩深度顯著低于CON組(P<0.05)；DW組絨毛表面積、絨隱比顯著高于CON組(P<0.05)，隱窩深度顯著低于CON組(P<0.05)。mix組、oi組和dw組之間絨毛 p="">0.05)；DW組絨毛高度顯著低于MIX組(P<0.05)，與oi組差異不顯著(p>0.05)。

42日齡時(shí)，在空腸中，OI組和DW組絨毛高度、絨毛表面積顯著高于CON組(P<0.05)；MIX組、OI組和DW組隱窩深度顯著低于CON組(P<0.05)，絨隱比顯著高于CON組(P<0.05)。DW組絨毛高度、絨隱比顯著高于MIX組和OI組(P<0.05)，絨毛表面積顯著高于MIX組(P<0.05)。在回腸中，MIX組、OI組和DW組絨毛高度和絨隱比顯著高于CON組(P<0.05)，MIX組和DW組絨毛表面積顯著高于CON組(P<0.05)，DW組隱窩深度顯著低于CON組(P<0.05)。DW組絨毛高度、絨毛表面積、絨隱比顯著高于MIX組和OI組(P<0.05)，mix組、oi組和dw組之間隱窩深度差異不顯著(p>0.05)。

2.4乳酸菌不同飼喂方式對(duì)盲腸菌群的影響

由表6可知，21日齡時(shí)，各組操作分類(lèi)單元(OTU)數(shù)量在465～692個(gè)，MIX組、OI組和DW組Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)與CON組相比有所提高；42日齡時(shí)，各組OTU數(shù)量在557～650個(gè)，MIX組、OI組和DW組Chao指數(shù)和Shannon 指數(shù)與CON組相比均有所提高，表明添加乳酸菌可提高菌落多樣性和豐富度。各組樣品的覆蓋度(coverage)均在0.99以上，說(shuō)明樣品中序列已基本全部檢測(cè)出。

在門(mén)水平上，各組優(yōu)勢(shì)菌群如圖1所示。21日齡時(shí)，各組核心菌門(mén)為厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)；CON組厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度最高，為88.37%，DW組擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度最高，為25.50%。42日齡時(shí)，各組核心菌門(mén)為厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、無(wú)壁菌門(mén)等；CON組厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、無(wú)壁菌門(mén)相對(duì)豐度較高，分別為88.37%、2.75%、2.68%，DW組擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度最高，為25.50%。

在屬水平上，各組優(yōu)勢(shì)菌群如圖2所示。21日齡時(shí)，各組盲腸菌群主要菌屬為糞球菌屬；CON組糞球菌屬相對(duì)豐度為36.77%，MIX組為18.75%，0I組為18.91%，DW組為33.67%。毛螺菌科未分類(lèi)屬也為優(yōu)勢(shì)菌屬，MIX組毛螺菌科未分類(lèi)屬相對(duì)豐度為12.34%，0I組為9.86%，DW組為12.76%。CON組糞球菌屬、梭菌屬相對(duì)豐度較高，分別為36.77%、6.08%。MIX組克里斯滕森菌科R-7群相對(duì)豐度最高，為16.12%。0I組令枝菌屬、乳桿菌屬相對(duì)豐度較高，分別為8.58%、4.58%。DW組毛螺菌科未分類(lèi)屬、瘤胃球菌科UCG-014相對(duì)豐度較高，分別為12.76%、9.07%。

42日齡時(shí)，CON組布勞特氏菌屬、梭菌屬、埃希氏菌屬相對(duì)豐度較高，分別為11.20%、8.63%、8.10%。MIX組毛螺菌科未分類(lèi)屬、糞球菌屬相對(duì)豐度較高，分別為15.49%、9.24%。0I組乳桿菌屬、克里斯滕森菌科R-7群相對(duì)豐度較高，分別為8.34%、4.60%。DW組梭菌屬、擬桿菌屬、令枝菌屬相對(duì)豐度較高，分別為28.65%、17.17%、6.90%。

由表7可知，21、42日齡時(shí)，MIX組、OI組和DW組盲腸雙歧桿菌數(shù)量均顯著高于CON組(P<0.05)，大腸桿菌數(shù)量顯著低于CON組(P<0.05)。21日齡時(shí)，DW組盲腸乳酸菌、雙歧桿菌數(shù)量顯著高于MIX組和OI組(P<0.05)，志賀氏菌數(shù)量顯著低于CON組、MIX組和OI組(P<0.05)，大腸桿菌數(shù)量顯著低于MIX組(P<0.05)。42日齡時(shí)，DW組、OI組盲腸雙歧桿菌數(shù)量顯著高于MIX組(P<0.05)，大腸桿菌數(shù)量顯著低于MIX組(P<0.05)。

3.1乳酸菌不同飼喂方式對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能和粗蛋白質(zhì)表觀代謝率的影響

很多研究認(rèn)為，乳酸菌可附著于動(dòng)物腸黏膜表面，改善腸道結(jié)構(gòu)，提高消化酶活性，促進(jìn)蛋白質(zhì)等有機(jī)物的消化吸收，從而提高對(duì)飼糧的代謝及利用率，在腸道中可以起到良好的益生作用。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌可通過(guò)提高采食量而提高肉雞生長(zhǎng)性能。本試驗(yàn)在1～21日齡時(shí)，DW組平均日采食量顯著低于CON組，與OI組和MIX組差異不顯著。產(chǎn)生差異的原因可能是乳酸菌可提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝率，進(jìn)而降低采食量。因?yàn)橛醒芯堪l(fā)現(xiàn)，飼喂肉雞嗜酸乳桿菌可顯著提高粗蛋白質(zhì)表觀代謝率。本試驗(yàn)42日齡時(shí)，MIX組、OI組和DW組粗蛋白質(zhì)表觀代謝率和平均日增重均高于CON組，也證實(shí)了這種可能性。此外，菌株的繁殖能力、能否代謝活性物質(zhì)及產(chǎn)生有機(jī)酸的不同，也可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。本研究發(fā)現(xiàn)，DW組和MIX組生長(zhǎng)性能和粗蛋白質(zhì)表觀代謝率無(wú)顯著差異，且均優(yōu)于OI組，可能是在飼喂過(guò)程中口腔灌服會(huì)導(dǎo)致肉雞應(yīng)激，使其精神萎靡，采食量減少，飼料利用率降低。

3.2乳酸菌不同飼喂方式對(duì)肉雞腸道健康的影響

腸道絨毛高度、隱窩深度和絨隱比是評(píng)價(jià)腸道功能的重要指標(biāo)。谷巍等研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌通過(guò)增加腸道絨隱比以增強(qiáng)小鼠免疫力，降低小鼠腹瀉率。肉雞飼糧中添加乳酸菌，也可提高絨隱比，降低嘔吐毒素污染飼糧對(duì)肉雞的不良影響。本研究中，以飲水方式飼喂乳酸菌菌液，肉雞小腸絨毛表面積、絨隱比顯著高于其他飼喂方式。分析其原因可能為：雖然本試驗(yàn)設(shè)計(jì)初為各組提供了等量乳酸菌，但受肉雞采食習(xí)性影響(漏料、滴水等)，加之拌料后菌種活菌數(shù)與菌液直接保存也存在細(xì)微差異，導(dǎo)致各組肉雞每日實(shí)際攝入活菌數(shù)量存在一定差異，影響飼喂效果。其中，以飲水方式飼喂乳酸菌菌液可保證菌液混合均勻，減少誤差，避免肉雞應(yīng)激，提高乳酸菌飼喂效果。

乳酸菌在腸道內(nèi)增殖，代謝出乳酸，抑制致病菌的增殖，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡。本研究發(fā)現(xiàn)，肉雞盲腸菌群在門(mén)水平上主要有厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、無(wú)壁菌門(mén)、變形菌門(mén)，在屬水平上主要有糞球菌屬、擬桿菌屬，與前人研究結(jié)果--致。研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)存在著共生關(guān)系，可共同促進(jìn)宿主吸收或儲(chǔ)存能量，若比例過(guò)高會(huì)導(dǎo)致宿主產(chǎn)生代謝綜合征。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼喂乳酸菌能降低厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度，促進(jìn)肉雞健康。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在屬水平上，MIX組、OI組和DW組大腸桿菌、志賀氏菌等致病菌屬相對(duì)豐度均低于CON組，與劉鳳美等研究結(jié)果一致。其中，以飲水方式飼喂乳酸菌菌液能顯著降低有害菌數(shù)量。DW組瘤胃球菌科UCG-014相對(duì)豐度最高，其主要發(fā)酵產(chǎn)物為乙酸、甲酸，可以降低腸道pH，減少有害菌的增殖。有報(bào)道表明，小鼠腸道菌群在乳酸菌干預(yù)后，乳桿菌屬豐富度顯著增加。本試驗(yàn)中，不同方式飼喂乳酸菌均可增加盲腸乳桿菌屬相對(duì)豐度，其中OI組、DW組盲腸乳桿菌屬相對(duì)豐度較高，與活菌計(jì)數(shù)結(jié)果相一致。

4結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，3種乳酸菌飼喂方式均可不同程度提高肉雞生長(zhǎng)性能和粗蛋白質(zhì)表觀代謝率，改善腸道形態(tài)和腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加有益菌數(shù)量，降低有害菌數(shù)量，其中以飲水方式飼喂效果更佳。

參考文獻(xiàn)：略。