1997年，克隆羊“多莉”誕生。隨后的21年時(shí)間里，已有20余種動(dòng)物相繼成功實(shí)現(xiàn)克隆。在追求打破新物種壁壘的同時(shí)，科學(xué)家們還在孜孜不倦地解決另一個(gè)問(wèn)題：克隆效率低下。

日前，中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴(lài)良學(xué)研究團(tuán)隊(duì)在豬體細(xì)胞克隆方面取得新進(jìn)展：將克隆效率提高7倍。相關(guān)成果發(fā)表在美國(guó)科學(xué)類(lèi)期刊《干細(xì)胞報(bào)告》(STEM CELL REPORTS)。

論文的第一作者阮德功在接受澎湃新聞(www.thepaper.cn)采訪(fǎng)時(shí)表示，“克隆不是自然界中自然發(fā)生的一個(gè)過(guò)程，它是一個(gè)人工的過(guò)程，克隆效率就會(huì)很低。即使像最新獲得的克隆猴，現(xiàn)階段克隆效率也是不高，全球僅獲得2例成功。”

定點(diǎn)失活XIST基因

所謂的克隆即體細(xì)胞核移植技術(shù)(Somatic Cell Nuclear Transfer，簡(jiǎn)稱(chēng)“SCNT”)，研究人員需要將一種體細(xì)胞培養(yǎng)后注入去除遺傳物質(zhì)的卵子，通過(guò)人工方法激活后再移植到代孕母體發(fā)育成個(gè)體。

“實(shí)際上，截至目前體細(xì)胞的重編程具體機(jī)制依然沒(méi)有被完全了解，重編程體系還是有待完善。體細(xì)胞是一種高度特化的細(xì)胞，要把它變成胚胎樣的細(xì)胞，自身屬性必然要被改變，在這個(gè)轉(zhuǎn)變的過(guò)程中就遇到諸多問(wèn)題，這就被稱(chēng)為重編程障礙。”阮德功表示。

以克隆猴為例，中科院上海神經(jīng)科學(xué)研究所孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)獲得成功的克隆猴體細(xì)胞來(lái)自于胎兒成纖維細(xì)胞，而成年猴體細(xì)胞的克隆猴出生后不久即死掉了(分別在出生3小時(shí)和30小時(shí)后死亡)。針對(duì)這一現(xiàn)象，同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院院長(zhǎng)高紹榮就點(diǎn)評(píng)，“這也反映了現(xiàn)在的克隆技術(shù)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不是完美，還需要我們進(jìn)一步去進(jìn)行重編程機(jī)制的探索?！?

對(duì)于豬而言，賴(lài)良學(xué)研究組在多年的克隆豬研究中發(fā)現(xiàn)，豬克隆胚胎移植到代孕母體后，大部分胎兒都會(huì)發(fā)生退化，其機(jī)制目前尚不清楚。阮德功提到，“此前的克隆效率基本不到1%?！?

研究團(tuán)隊(duì)最新的這項(xiàng)研究主要集中于體細(xì)胞重編程過(guò)程中的兩方面障礙。據(jù)阮德功介紹，“其中一方面X染色體上長(zhǎng)鏈非編碼RNA XIST，它對(duì)重編程有很大的阻礙作用?！?

研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)基因編輯技術(shù)，定點(diǎn)失活XIST基因?！拔覀円浦擦?30枚XIST敲除克隆胚胎和953枚對(duì)照胚胎到5頭代孕母體中，XIST敲除胚胎產(chǎn)生11頭豬，但是野生型只有3頭，所以克隆效率分別為2.07%和0.3%”

這也就意味著，通過(guò)敲除XIST基因，豬的克隆效率提高了大約7倍。

兩道重編程障礙如何關(guān)聯(lián)

研究團(tuán)隊(duì)此次聚焦的另一大重編程障礙是成體細(xì)胞的表觀遺傳修飾，例如H3K9me3甲基化。阮德功提到，“成體細(xì)胞中胚胎表達(dá)的基因都是沉默的，這種基因沉默就是靠這些表觀遺傳，但是在重編程的過(guò)程中要重新開(kāi)啟胎胚發(fā)育所需要的基因?！?

研究人員發(fā)現(xiàn)，如果把XIST基因敲除掉，它能夠很好地提高豬的克隆效率，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)胚胎H3K9me3甲基化這種抑制狀態(tài)也會(huì)下調(diào)。這也就意味，豬克隆效率越高，H3K9me3甲基化水平也會(huì)越低。

接下來(lái)，研究人員通過(guò)向XIST基因未敲除克隆胚胎中注射H3K9me3去甲基化酶來(lái)主動(dòng)下調(diào)H3K9me3甲基化水平，從而觀察是否會(huì)提高豬的克隆效率。

“這些胚胎移植到體內(nèi)之后并沒(méi)有提高總體的克隆效率，這就讓XIST基因和H3K9me3甲基化之間產(chǎn)生了一個(gè)聯(lián)系。XIST基因本身就是被H3K9me3甲基化抑制住的，如果再主動(dòng)下調(diào)H3K9 me3甲基化水平，相當(dāng)于把它對(duì)XIST基因的抑制作用給消除了。這最終就會(huì)抑制重編程，抑制豬胚胎的體內(nèi)發(fā)育?！比畹鹿Ρ硎尽?

值得注意的是，研究團(tuán)隊(duì)此番是首次闡述了豬身上XIST基因和H3K9me3甲基化之間存在關(guān)聯(lián)。

大動(dòng)物克隆研究稀缺

回到研究團(tuán)隊(duì)的初衷，即提高豬克隆的克隆效率。阮德功提到，“這實(shí)際上是各物種普遍存在問(wèn)題”。而因?yàn)橘Y源限制等因素，大動(dòng)物克隆研究尤其不易?！澳壳按蠹宜械难芯慷技性谛∈笊砩希瑢?duì)大動(dòng)物的研究，全球也沒(méi)幾家實(shí)驗(yàn)室可以做，范圍和深度都有限，對(duì)大動(dòng)物的了解也是不夠的?！?

以阮德功此番研究所用的豬舉例，“豬的克隆研究就得有配套的養(yǎng)豬場(chǎng)，不像小鼠那樣簡(jiǎn)單。另外豬的實(shí)驗(yàn)周期相對(duì)也較長(zhǎng)，研究人員需要付出很大的成本，出成果也很慢，像小鼠一個(gè)月就能生一輪，豬就得三個(gè)多月。最新獲得的克隆猴在這方面就更難，周期比豬還長(zhǎng)，還不像豬一樣是多胎生育，而是單胎”。

阮德功坦言，“能得到一個(gè)可以發(fā)文章的結(jié)果還是比較難的，所以大動(dòng)物克隆研究背后必須有強(qiáng)大的支持力量?！?

據(jù)阮德功介紹，目前克隆豬的用途主要在提供疾病模型、作為異種器官移植的供體和農(nóng)業(yè)育種。

尤其在異種器官移植方面，豬具有天然優(yōu)勢(shì)。

豬于一萬(wàn)多年前被人類(lèi)馴養(yǎng)，其生理指標(biāo)、代謝系統(tǒng)以及基因的相似度都與人類(lèi)相似，器官大小和功能與人類(lèi)器官也高度相似，包括腎、心、肝、胰島細(xì)胞、皮膚和角膜等器官和組織是能移植到人身上的最佳異種器官。

另外，豬具備繁殖快、無(wú)倫理之爭(zhēng)等優(yōu)勢(shì)，目前被認(rèn)為是解決人類(lèi)器官短缺的理想供體。

就在2017年12月，中國(guó)西南生物多樣性實(shí)驗(yàn)室誕生出了世界首批內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒被滅活的豬，這也意味著豬異種器官移植最大的障礙，也就是豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒引起的安全性問(wèn)題和排斥反應(yīng)已被解除。研究團(tuán)隊(duì)當(dāng)時(shí)預(yù)計(jì)稱(chēng)，2020年將實(shí)現(xiàn)豬到人的器官異種移植。