農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳關(guān)于進(jìn)一步嚴(yán)厲打擊違法研制生產(chǎn)經(jīng)營使用非洲豬瘟疫苗行為的通知

各省、自治區(qū)、直轄市農(nóng)業(yè)農(nóng)村（農(nóng)牧、畜牧獸醫(yī)）廳（局、委），新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局：

截至目前，包括中國在內(nèi)的世界各國均未批準(zhǔn)生產(chǎn)經(jīng)營使用非洲豬瘟商品化疫苗，但非法使用非洲豬瘟疫苗問題時(shí)有反映。為切實(shí)推動(dòng)非洲豬瘟防控工作有序開展，保持生豬生產(chǎn)恢復(fù)向好勢(shì)頭，現(xiàn)就嚴(yán)厲打擊違法研制生產(chǎn)經(jīng)營使用非洲豬瘟疫苗行為有關(guān)事項(xiàng)通知如下。

一、嚴(yán)厲打擊違法研制非洲豬瘟疫苗行為

各省級(jí)畜牧獸醫(yī)主管部門要組織對(duì)轄區(qū)內(nèi)科研教學(xué)單位、企業(yè)等所有獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室開展排查活動(dòng)，重點(diǎn)檢查是否違法從事非洲豬瘟疫苗研制活動(dòng)；對(duì)實(shí)驗(yàn)室冰箱保存的無標(biāo)簽疫苗、病料或成份不明的試劑，要開展檢查檢測(cè)確認(rèn)；對(duì)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)記錄等要進(jìn)行仔細(xì)核查。如發(fā)現(xiàn)有非洲豬瘟疫苗制苗用種毒或試制疫苗，要進(jìn)一步核實(shí)種毒和試制疫苗的使用和去向情況。如發(fā)現(xiàn)涉嫌違法制售非洲豬瘟疫苗線索，要立即立案查處，依照《獸藥管理?xiàng)l例》《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》從嚴(yán)從快從重處理；涉嫌犯罪的，依法移送公安機(jī)關(guān)追究刑事責(zé)任。要加強(qiáng)對(duì)非洲豬瘟疫苗實(shí)驗(yàn)室研究、臨床試驗(yàn)單位和中試生產(chǎn)企業(yè)監(jiān)督檢查，重點(diǎn)檢查開展非洲豬瘟疫苗研究的實(shí)驗(yàn)室條件是否符合要求，實(shí)驗(yàn)活動(dòng)、臨床試驗(yàn)等是否經(jīng)過審批，臨床試驗(yàn)范圍等是否與批準(zhǔn)的試驗(yàn)方案一致，中試條件和生物安全防范措施是否符合要求，是否存在非法轉(zhuǎn)移中試產(chǎn)品及其種毒行為等。發(fā)現(xiàn)未經(jīng)批準(zhǔn)、擅自開展非洲豬瘟疫苗相關(guān)實(shí)驗(yàn)室研究活動(dòng)、臨床試驗(yàn)或非法轉(zhuǎn)移中試產(chǎn)品及其種毒的，要立案查處，并依照《獸藥管理?xiàng)l例》《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》從嚴(yán)從快從重處罰。

二、嚴(yán)厲打擊違法生產(chǎn)非洲豬瘟疫苗行為

各省級(jí)畜牧獸醫(yī)主管部門要組織對(duì)轄區(qū)內(nèi)獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)開展全面檢查，排查是否存在違法制售非洲豬瘟疫苗行為。重點(diǎn)檢查生產(chǎn)企業(yè)的隱蔽場(chǎng)所、原材料出入庫情況、試驗(yàn)動(dòng)物購買和使用情況、資金往來情況等，全面查找非法制售假疫苗線索。如發(fā)現(xiàn)違法制售非洲豬瘟疫苗行為，要進(jìn)一步核查疫苗生產(chǎn)銷售數(shù)量和銷售對(duì)象、生產(chǎn)種毒來源等信息，并依照《獸藥管理?xiàng)l例》第五十六條規(guī)定和《獸藥嚴(yán)重違法行為從重處罰情形》從嚴(yán)從快從重處理，吊銷《獸藥生產(chǎn)許可證》，獸藥生產(chǎn)企業(yè)主要負(fù)責(zé)人和直接負(fù)責(zé)的主管人員終身不得從事獸藥生產(chǎn)活動(dòng)。涉嫌犯罪的，及時(shí)依法移送公安機(jī)關(guān)追究刑事責(zé)任。

三、嚴(yán)厲打擊違法經(jīng)營非洲豬瘟疫苗行為

各省級(jí)畜牧獸醫(yī)主管部門要組織對(duì)轄區(qū)內(nèi)獸藥經(jīng)營企業(yè)開展全面檢查，排查是否存在經(jīng)營所謂“非洲豬瘟中試苗、自家苗、進(jìn)口苗”等非法疫苗行為。重點(diǎn)檢查無標(biāo)簽疫苗、出入庫記錄、資金往來等情況，全面查找違法經(jīng)營假疫苗線索。如發(fā)現(xiàn)違法經(jīng)營非洲豬瘟疫苗行為，要進(jìn)一步核查假疫苗來源、銷售對(duì)象和數(shù)量等信息，并依照《獸藥管理?xiàng)l例》第五十六條規(guī)定和《獸藥嚴(yán)重違法行為從重處罰情形》從嚴(yán)從快從重處理，吊銷《獸藥經(jīng)營許可證》，獸藥經(jīng)營企業(yè)主要負(fù)責(zé)人和直接負(fù)責(zé)的主管人員終身不得從事獸藥經(jīng)營活動(dòng)。涉嫌犯罪的，及時(shí)依法移送公安機(jī)關(guān)追究刑事責(zé)任。

四、嚴(yán)厲打擊違法使用非洲豬瘟疫苗行為

各省級(jí)畜牧獸醫(yī)主管部門要組織對(duì)轄區(qū)內(nèi)生豬養(yǎng)殖企業(yè)（場(chǎng)、戶）開展檢查，排查是否存在違法使用非洲豬瘟疫苗行為。重點(diǎn)檢查冰箱冰柜是否保存有可疑疫苗、疫苗購買記錄、免疫接種記錄、檢測(cè)記錄、資金往來等信息，全面查找違法使用假疫苗線索。如發(fā)現(xiàn)違法使用非洲豬瘟疫苗行為，要進(jìn)一步核查假疫苗來源和數(shù)量等信息，并依據(jù)《獸藥管理?xiàng)l例》第六十二條和《獸藥嚴(yán)重違法行為從重處罰情形》從嚴(yán)從快從重處罰。必要時(shí)商請(qǐng)公安機(jī)關(guān)聯(lián)合辦案，一查到底。對(duì)養(yǎng)殖企業(yè)（場(chǎng)、戶）使用非洲豬瘟非法疫苗免疫接種的豬只，一經(jīng)檢測(cè)為陽性的，視為非洲豬瘟感染豬，予以撲殺，并不得給予補(bǔ)助。

五、組織開展非洲豬瘟疫苗毒鑒別檢測(cè)

各省級(jí)畜牧獸醫(yī)主管部門在按照《2020年全國非洲豬瘟監(jiān)測(cè)方案》組織做好轄區(qū)內(nèi)非洲豬瘟監(jiān)測(cè)基礎(chǔ)上，要組織開展鑒別檢測(cè)，對(duì)來自養(yǎng)殖場(chǎng)、采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)結(jié)果為陽性的組織、血液或口鼻拭子等樣品，可按照“非洲豬瘟病毒流行株與基因缺失株鑒別檢測(cè)規(guī)范”（見附件）進(jìn)行鑒別檢測(cè)。鑒別檢測(cè)結(jié)果顯示為基因缺失病毒的，各檢測(cè)單位要第一時(shí)間將檢測(cè)結(jié)果及樣品來源信息報(bào)省級(jí)畜牧獸醫(yī)主管部門。對(duì)涉嫌違法單位，省級(jí)畜牧獸醫(yī)主管部門要立即組織立案查處。

中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心和中國動(dòng)物衛(wèi)生流行病學(xué)中心在開展非洲豬瘟病毒監(jiān)測(cè)的同時(shí)，要對(duì)來自養(yǎng)殖場(chǎng)、采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)結(jié)果為陽性的組織、血液或口鼻拭子等樣品進(jìn)行鑒別檢測(cè)。鑒別檢測(cè)結(jié)果顯示為基因缺失病毒的，第一時(shí)間將檢測(cè)結(jié)果及樣品來源信息報(bào)我部畜牧獸醫(yī)局。

六、嚴(yán)格執(zhí)行非洲豬瘟疫苗“五禁止”監(jiān)管措施

非洲豬瘟疫苗監(jiān)管工作對(duì)非洲豬瘟疫情防控和生豬生產(chǎn)恢復(fù)影響深遠(yuǎn)，采取強(qiáng)力措施、堅(jiān)決遏制非法研制生產(chǎn)經(jīng)營使用非洲豬瘟疫苗行為是目前各地畜牧獸醫(yī)主管部門面臨的緊迫任務(wù)。為保證非洲豬瘟疫苗監(jiān)管職責(zé)落實(shí)到位，各地畜牧獸醫(yī)主管部門和相關(guān)從業(yè)人員要嚴(yán)格執(zhí)行非洲豬瘟疫苗“五禁止”監(jiān)管措施，即：禁止未經(jīng)批準(zhǔn)開展實(shí)驗(yàn)活動(dòng)，禁止未經(jīng)審批開展臨床試驗(yàn)，禁止生產(chǎn)非法疫苗，禁止經(jīng)營非法疫苗，禁止使用非法疫苗。對(duì)存在違法研制生產(chǎn)經(jīng)營非洲豬瘟疫苗行為的單位及其主要負(fù)責(zé)人、直接負(fù)責(zé)的主管人員，一經(jīng)查實(shí)，全部列入失信懲戒名單，列為重點(diǎn)監(jiān)管對(duì)象，從嚴(yán)審核行政許可審批事項(xiàng)。

各省級(jí)畜牧獸醫(yī)主管部門要及時(shí)總結(jié)打擊違法研制生產(chǎn)經(jīng)營使用非洲豬瘟疫苗行為進(jìn)展情況，并于11月30日前將相關(guān)工作情況報(bào)送我部畜牧獸醫(yī)局。

附件：非洲豬瘟病毒流行株與基因缺失株鑒別檢測(cè)規(guī)范

附件

非洲豬瘟病毒流行株與基因缺失株鑒別檢測(cè)規(guī)范

本規(guī)范適用于非洲豬瘟病毒流行毒株與非洲豬瘟病毒CD2v和MGF 360-505R基因缺失株的熒光PCR方法鑒別檢測(cè)。

1.主要試劑

1.1 核酸提取試劑盒。

1.2 無核酸酶水。

1.3 熒光PCR預(yù)混液（2×）。

1.4 引物和探針：P72、CD2v、MGF360-505R基因擴(kuò)增引物和探針由國家非洲豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并提供（聯(lián)系人：李林，電話：0532-87839188）。

1.5 陽性和陰性對(duì)照：陽性對(duì)照樣品為ASFV基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（用無核酸酶水稀釋1000倍后使用），由國家非洲豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室提供；陰性對(duì)照樣品為無核酸酶水。

2. 主要儀器設(shè)備

2.1 熒光PCR擴(kuò)增儀。

2.2 臺(tái)式低溫高速離心機(jī)。

2.3 組織勻漿機(jī)。

2.4 微量可調(diào)移液器（2.5 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL等不同規(guī)格）。

2.5 無核酸酶離心管與吸頭。

2.6 PCR擴(kuò)增管。

3. 樣品采集和運(yùn)輸保存

對(duì)活豬，可采集抗凝全血（EDTA抗凝）、口鼻拭子或血清等；對(duì)病死豬或已屠宰豬，可采集脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體、肝臟等組織。盡快送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)。

樣品的運(yùn)送與保存應(yīng)滿足NY/T 541《獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范》相關(guān)要求。上述樣品可在4°C最長保存2天；如需長時(shí)間保存，應(yīng)置于-20°C以下。

4.樣品處理

4.1 組織樣品

取0.1 g～0.2 g樣品，加入1 mL～2 mL預(yù)冷的PBS（pH 7.4），用組織勻漿機(jī)高速勻漿，制成10%組織勻漿液，以5000 r/min離心10 min，取200 μL上清液進(jìn)行核酸提取。

4.2 液體樣品

抗凝全血、血清等液體樣品不需進(jìn)行特殊處理，直接取200 μL進(jìn)行核酸提取。

5.病毒核酸的提取和純化

取已進(jìn)行前處理的樣品200 μL，可按傳統(tǒng)方法提取病毒核酸，也可采用病毒核酸提取試劑盒、自動(dòng)化核酸提取儀提取病毒核酸。提取后的病毒核酸應(yīng)立即使用或置于-20°C以下冷凍保存。每次抽提核酸，應(yīng)包括一個(gè)陽性對(duì)照樣品和一個(gè)陰性對(duì)照樣品。

6. 熒光PCR檢測(cè)

6.1熒光PCR反應(yīng)液制備

在滅菌的離心管中制備符合檢測(cè)樣品數(shù)量（包括陽性、陰性對(duì)照）要求的熒光PCR反應(yīng)混合液，至少額外制備兩個(gè)樣品的量。每個(gè)樣品配制20 μL PCR反應(yīng)混合液，組成如下：7.5 mL P72、CD2v、MGF360-505R基因引物、探針預(yù)混液（P72、CD2v、MGF360-505R基因探針分別用FAM、VIC和Cy5進(jìn)行標(biāo)記）、12.5 mL 2×探針法熒光PCR預(yù)混液。

分別取20 μL PCR反應(yīng)混合液加至每個(gè)PCR擴(kuò)增管中；再分別取5 μL DNA模板加入到PCR擴(kuò)增管中。每次進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增時(shí)均應(yīng)設(shè)立陽性、陰性對(duì)照。陽性對(duì)照應(yīng)用陽性對(duì)照樣品所提取核酸作為模板，陰性對(duì)照應(yīng)用陰性對(duì)照樣品所提取核酸作為模板。加入模板后，密封PCR擴(kuò)增管，瞬時(shí)離心。將所有PCR擴(kuò)增管放在熒光PCR儀中。按下述條件運(yùn)行擴(kuò)增程序。

6.2 熒光PCR擴(kuò)增條件

50°C孵育2min；95°C預(yù)變性5min；95°C變性15s，60°C退火延伸1min，45個(gè)循環(huán)，在每一循環(huán)的60°C時(shí)收集FAM、VIC和Cy5通道中的熒光信號(hào)。

6.3 結(jié)果分析

Ct值由熒光PCR儀的軟件自動(dòng)確定。

6.3.1 試驗(yàn)成立條件

陽性對(duì)照P72、CD2v、MGF 360-505R基因的Ct值均＜35且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照P72、CD2v、MGF 360-505R基因無Ct值或陰性對(duì)照P72、CD2v、MGF 360-505R基因Ct值≥40且無特異性擴(kuò)增曲線，判為試驗(yàn)有效。試驗(yàn)無效時(shí)應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)。

6.3.2 P72、CD2v、MGF 360-505R基因檢測(cè)結(jié)果判定

6.3.2.1P72基因檢測(cè)結(jié)果判定（FAM通道）

被檢樣品Ct值≤38且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判為ASFV P72基因檢測(cè)陽性；無Ct值或Ct值≥40，判為ASFV P72基因檢測(cè)陰性；38＜Ct值＜40且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判為疑似。對(duì)疑似樣品，再進(jìn)行1次復(fù)檢，做3個(gè)重復(fù)；至少2個(gè)重復(fù)Ct值＜40且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線即判為ASFV P72基因檢測(cè)陽性，否則判為ASFV P72基因檢測(cè)陰性。

6.3.2.2 CD2v基因檢測(cè)結(jié)果判定（VIC通道）

被檢樣品Ct值≤38且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判為ASFV CD2v基因檢測(cè)陽性；無Ct值或Ct值≥40，判為ASFV CD2v基因檢測(cè)陰性；38＜Ct值＜40且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判為疑似。對(duì)疑似樣品，再進(jìn)行1次復(fù)檢，做3個(gè)重復(fù)；至少2個(gè)重復(fù)Ct值＜40且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線即判為ASFV CD2v基因檢測(cè)陽性，否則判為ASFV CD2v基因檢測(cè)陰性。

6.3.2.3MGF 360-505R基因檢測(cè)結(jié)果判定（Cy5通道）

被檢樣品Ct值≤38且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判為ASFV MGF 360-505R基因檢測(cè)陽性；無Ct值或Ct值≥40，判為ASFV MGF 360-505R基因檢測(cè)陰性；當(dāng)38＜Ct值＜40且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判為疑似。對(duì)疑似樣品，再進(jìn)行1次復(fù)檢，做3個(gè)重復(fù)；至少2個(gè)重復(fù)Ct值＜40且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線即判為ASFV MGF 360-505R基因檢測(cè)陽性，否則判為ASFV MGF 360-505R基因檢測(cè)陰性。

6.3.3 綜合判定

結(jié)合P72、CD2v、MGF 360-505R等3個(gè)基因的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合判定。具體判定標(biāo)準(zhǔn)見附表。

附表 綜合判定標(biāo)準(zhǔn)

綜合判定結(jié)果	檢測(cè)結(jié)果
	P72-FAM	CD2v-VIC	MGF-Cy5
ASFV流行株陽性	+	+	+
ASFV CD2v基因缺失株陽性	+	-	+
ASFV MGF基因缺失株陽性	+	+	-
ASFV CD2v與MGF基因雙缺失株陽性	+	-	-
ASFV陰性	-	-	-

注：“+”代表檢測(cè)陽性；“-”代表檢測(cè)陰性

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳

2020年8月24日

抄送單位：中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心